Die zytogenetische Methode untersucht. Genetische Methoden

Zytogenetische (karyotypische, karyotypische) Methoden werden hauptsächlich bei der Untersuchung von Karyotypen einzelner Individuen verwendet.

Der Kern dieser Methode besteht darin, die Struktur einzelner Chromosomen sowie die Eigenschaften des Chromosomensatzes menschlicher Zellen unter normalen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Als geeignetes Objekt hierfür dienen Lymphozyten, bukkale Epithelzellen und andere Zellen, die leicht zu gewinnen, zu kultivieren und einer karyologischen Analyse zu unterziehen sind. Dies ist eine wichtige Methode zur Bestimmung des Geschlechts und der chromosomalen Erbkrankheiten eines Menschen.

Grundlage der zytogenetischen Methode ist die Untersuchung der Morphologie einzelner Chromosomen menschlicher Zellen. Das moderne Stadium des Verständnisses der Struktur von Chromosomen ist gekennzeichnet durch die Erstellung molekularer Modelle dieser wichtigsten Strukturen des Zellkerns und die Untersuchung der Rolle einzelner Chromosomenkomponenten bei der Speicherung und Übertragung erblicher Informationen.

Veränderungen des Karyotyps gehen meist mit der Entstehung genetischer Erkrankungen einher. Durch die Kultivierung menschlicher Zellen ist es möglich, schnell ausreichend großes Material für die Herstellung von Präparaten zu erhalten. Zur Karyotypisierung wird üblicherweise eine Kurzzeitkultur peripherer Blutleukozyten verwendet.

Zytogenetische Methoden werden auch zur Beschreibung von Interphasezellen eingesetzt. Beispielsweise ist es durch das Vorhandensein oder Fehlen von Geschlechtschromatin (Barr-Körper, bei denen es sich um inaktivierte X-Chromosomen handelt) nicht nur möglich, das Geschlecht von Individuen zu bestimmen, sondern auch einige genetische Krankheiten zu identifizieren, die mit einer Veränderung der Anzahl von Chromosomen.

Die Methode ermöglicht die Identifizierung des Karyotyps (Strukturmerkmale und Chromosomenzahl) durch die Aufnahme eines Karyogramms. Bei Verdacht auf ein Chromosomensyndrom oder eine andere Chromosomenstörung wird eine zytogenetische Untersuchung des Probanden, seiner Eltern, Verwandten oder des Fötus durchgeführt.

Karyotypisierung- Zytogenetische Methode – ermöglicht die Identifizierung von Abweichungen in der Struktur und Anzahl der Chromosomen, die zu Unfruchtbarkeit, anderen Erbkrankheiten und der Geburt eines kranken Kindes führen können.

In der medizinischen Genetik sind zwei Hauptarten der Karyotypisierung relevant:

1. Untersuchung des Karyotyps von Patienten
2. Pränatale Karyotypisierung – Untersuchung fetaler Chromosomen

Zytogenetische Methode zur Untersuchung der Humangenetik. Bestimmung von X- und Y-Chromatin. Der Wert der Methode für die Diagnose von Chromosomenerkrankungen, die mit Anomalien in der Anzahl der Geschlechtschromosomen im Karyotyp verbunden sind.

Bestimmung von X- und Y-Chromatin wird oft als Methode der schnellen Sexualdiagnostik bezeichnet. Untersuchen Sie die Zellen der Schleimhaut der Mundhöhle, des Vaginalepithels oder der Haarfollikel. In den Kernen weiblicher Zellen im diploiden Satz befinden sich zwei X-Chromosomen, von denen eines bereits in den frühen Stadien der Embryonalentwicklung vollständig inaktiviert (spiralisiert, dicht gepackt) ist und als an der Kernhülle befestigter Heterochromatinklumpen sichtbar ist . Ein inaktiviertes X-Chromosom wird Sexchromatin oder Barr-Körper genannt. Um Geschlechts-X-Chromatin (Barr-Körper) in den Zellkernen nachzuweisen, werden Ausstriche mit Acetarcein angefärbt und die Präparate unter einem herkömmlichen Lichtmikroskop betrachtet. Normalerweise haben Frauen einen Klumpen X-Chromatin, Männer dagegen nicht.

Um männliches Y-Geschlechtschromatin (F-Körper) zu identifizieren, werden Abstriche mit Chinacrin angefärbt und unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Y-Chromatin zeigt sich in Form eines stark leuchtenden Punkts, der sich in Größe und Intensität der Lumineszenz von den übrigen Chromozentren unterscheidet. Es kommt in den Zellkernen des männlichen Körpers vor.

Das Fehlen eines Barr-Körpers bei Frauen weist auf eine Chromosomenerkrankung hin – das Shereshevsky-Turner-Syndrom (Karyotyp 45, X0). Das Vorhandensein eines Barr-Körperchens bei Männern weist auf das Klinefelter-Syndrom (Karyotyp 47, XXY) hin.

Die Bestimmung von X- und Y-Chromatin ist eine Screening-Methode. Die endgültige Diagnose einer Chromosomenerkrankung wird erst nach der Untersuchung des Karyotyps gestellt.

Zytogenetische Methode

Die zytogenetische Methode wird zur Untersuchung des normalen menschlichen Karyotyps sowie zur Diagnose von Erbkrankheiten im Zusammenhang mit genomischen und chromosomalen Mutationen eingesetzt.
Darüber hinaus wird diese Methode bei der Untersuchung der mutagenen Wirkung verschiedener Chemikalien, Pestizide, Insektizide, Medikamente usw. verwendet.
Während der Zellteilung im Metaphasestadium weisen die Chromosomen eine klarere Struktur auf und stehen für Studien zur Verfügung. Der menschliche diploide Satz besteht aus 46 Chromosomen:
22 Autosomenpaare und ein Geschlechtschromosomenpaar (XX bei Frauen, XY bei Männern). Üblicherweise werden menschliche periphere Blutleukozyten untersucht, die in ein spezielles Nährmedium gegeben werden und sich dort teilen. Anschließend werden Präparate vorbereitet und die Anzahl und Struktur der Chromosomen analysiert. Die Entwicklung spezieller Färbemethoden hat die Erkennung aller menschlichen Chromosomen erheblich vereinfacht und in Verbindung mit der genealogischen Methode sowie Methoden der Zell- und Gentechnik die Korrelation von Genen mit bestimmten Chromosomenbereichen ermöglicht. Die komplexe Anwendung dieser Methoden liegt der Kartierung menschlicher Chromosomen zugrunde.

Für die Diagnose von Chromosomenerkrankungen im Zusammenhang mit Ansuploidie und Chromosomenmutationen ist eine zytologische Kontrolle erforderlich. Am häufigsten sind Morbus Down (Trisomie auf dem 21. Chromosom), Klinefelter-Syndrom (47 XXY), Shershevsky-Turner-Syndrom (45 XO) usw. Der Verlust eines Abschnitts eines der homologen Chromosomen des 21. Paares führt zu a Blutkrankheit - chronische myeloische Leukämie.

Zytologische Untersuchungen der Interphasekerne somatischer Zellen können den sogenannten Barr-Körper oder Sexualchromatin aufdecken. Es stellte sich heraus, dass Sexchromatin normalerweise bei Frauen vorhanden ist und bei Männern fehlt. Es ist das Ergebnis der Heterochromatisierung eines der beiden X-Chromosomen bei Frauen. Wenn man dieses Merkmal kennt, ist es möglich, das Geschlecht zu bestimmen und eine abnormale Anzahl von X-Chromosomen zu identifizieren.

Die Erkennung vieler Erbkrankheiten ist bereits vor der Geburt eines Kindes möglich. Die Methode der Pränataldiagnostik besteht in der Gewinnung von Fruchtwasser, wo sich die Zellen des Fötus befinden, und in der anschließenden biochemischen und zytologischen Bestimmung möglicher erblicher Anomalien. Dadurch können Sie bereits im Frühstadium der Schwangerschaft eine Diagnose stellen und entscheiden, ob Sie die Schwangerschaft fortsetzen oder abbrechen möchten.

Die Zytogenetik ist ein eigenständiger Zweig der Vererbungslehre, der verschiedene, vor allem beobachtbare (erklärte) Träger untersucht, die Informationen über die genetische Vererbung enthalten. Solche Träger sind Chromosomen verschiedener Typen (polytän, mitotisch und meiotisch), Plastiden, Interphasekerne und in geringerem Maße Mitochondrien.

Darauf aufbauend handelt es sich bei der zytogenetischen Methode um eine Reihe von Methoden und Technologien zur Untersuchung zunächst von Chromosomen, bei denen ihre quantitativen Parameter ermittelt, ihre chemische und biologische Beschreibung vorgenommen sowie die Struktur und Verhaltensweisen bei der Zellteilung untersucht werden . Die wissenschaftliche Aufgabe dieser Studie besteht darin, einen Zusammenhang zwischen der Art und Dynamik von Veränderungen in der Struktur von Chromosomen und einem Bild herzustellen, das die Variabilität von Charakteren widerspiegelt.

Einer der wichtigsten Forschungsbereiche der zytogenetischen Methode ist die Analyse des menschlichen Karyotyps. Diese Studie wird in der Regel an Kulturen durchgeführt, in denen die Teilung von Keim- und Körperzellen stattfindet.

Die gebräuchlichste Kultur für diese Art von Forschung sind periphere Blutzellen wie Lymphozyten, Fibroblasten und Knochenmarkszellen. Die am besten zugängliche Kultur, die in der medizinischen Zytogenetik verwendet wird, sind Blutlymphozyten. Der Grund dafür liegt darin, dass sie in der Regel Gegenstand der Analyse sind und im Falle des Fötus bei der zytogenetischen Methode Zellkulturen zum Einsatz kommen, deren Auswahl von einer Reihe von Faktoren bestimmt wird. Der wichtigste Faktor ist das Gestationsalter. Beispielsweise erfolgt die zytogenetische Chromosomenanalyse in diesem Zeitraum von weniger als 12 Wochen am besten unter Beteiligung von Chorionzellen, und bei einem Gestationsalter von mehr als 12 Wochen ist es ratsam, die Zellen des Fötus selbst für die Forschung zu berücksichtigen. Zu diesem Zweck werden sie speziell aus der Plazenta und dem fetalen Blut isoliert.

Zur Feststellung eines Karyotyps erfordert die zytogenetische Vererbung die Entnahme einer Blutprobe in einer Menge von mindestens 1-2 ml. Gleichzeitig beinhaltet die Methode selbst die Durchführung einer Studie, die aus drei Hauptphasen besteht:

Isolierung und an der die Analyse durchgeführt wird;

Die Farbe der Droge;

Durchführung einer gründlichen Analyse des Arzneimittels unter dem Mikroskop.

Die zytogenetische Methode der Genetik kann nur dann wirksam sein, wenn die folgenden Bedingungen erfüllt sind. Erstens muss eine bestimmte Anzahl von Zellen im Metaphasestadium vorhanden sein. Zweitens muss der Anbau unter strikter Einhaltung der festgelegten Regeln und über einen Zeitraum von mindestens 72 Stunden erfolgen. Drittens sollte die Fixierung der Zellen mit einer Lösung und Methanol in einem strikten Verhältnis dieser Substanzen von 3:1 erfolgen.

In der Färbephase wird die Auswahl der Farben unter Berücksichtigung des eigentlichen Zwecks der Studie vorbereitet, d. h. welche Art von Neuanordnungen untersucht werden müssen. Am häufigsten wird die Methode der kontinuierlichen Färbung verwendet, da sie sich am einfachsten zur Bestimmung des quantitativen Parameters von Chromosomen eignet. Die moderne Forschung nutzt diese Färbemethode vor allem zur Bestimmung von Karyotypanomalien in ihrer quantitativen Ausprägung. Eine solche zytogenetische Methode ermöglicht es jedoch nicht, die Strukturdynamik von Chromosomen zu bestimmen und aufzudecken. Daher kommen andere, spezielle Methoden zum Einsatz, die es ermöglichen, diesen Nachteil der kontinuierlichen Färbemethode auszugleichen. Die gebräuchlichsten davon sind die Methode der differenzierten Färbung, die G-Methode, die R-Methode und andere.

Und schließlich besteht die dritte Phase der Studie in der mikroskopischen Untersuchung gefärbter Chromosomen, die sich im Metaphasestadium befinden. Dabei wird die Anzahl der normalen und abnormalen Zellen des menschlichen fetalen Körpers ermittelt. Hierzu wird in der Regel eine Analyse mehrerer Gewebe durchgeführt.

Die Methode ermöglicht die Identifizierung des Karyotyps (Strukturmerkmale und Chromosomenzahl) durch die Aufnahme eines Karyogramms. Bei Verdacht auf ein Chromosomensyndrom oder eine andere Chromosomenstörung wird eine zytogenetische Untersuchung des Probanden, seiner Eltern, Verwandten oder des Fötus durchgeführt.

Zur Bestimmung des Karyotyps werden sowohl direkte als auch indirekte Forschungsmethoden verwendet. Im ersten Fall wird Material aus Knochenmark, Lymphknoten, embryonalem Gewebe, Chorion, Fruchtwasserzellen oder anderen Geweben unmittelbar nach Erhalt untersucht. Die direkte Methode ist jedoch nur dann aussagekräftig, wenn im Material eine ausreichende Anzahl mitotischer Metaphasen vorhanden ist, da die Chromosomen erst in dieser Phase ihre inhärenten Strukturmerkmale erwerben und ihre genaue Identifizierung möglich ist. Derzeit werden häufig indirekte Forschungsmethoden eingesetzt.

Verfahren zur Herstellung von Metaphasenplatten. Die entnommene Kultur (periphere Blutlymphozyten etc.) wird zur Kultivierung in ein Nährmedium gegeben. Normalerweise wird im peripheren Blut keine Mitose von Lymphozyten beobachtet, daher werden Medikamente (Phytohämagglutinin) verwendet, die die immunologische Transformation von Lymphozyten und deren Teilung stimulieren. Der zweite Schritt besteht darin, die mitotische Zellteilung im Metaphasestadium zu stoppen. Dies wird erreicht, indem der Gewebekultur 2-3 Stunden vor Ende der Kultivierung Colchicin oder Colcimed zugesetzt wird. Im dritten Stadium wird mit einer hypotonischen Lösung von Calciumchlorid oder Natriumcitrat eine Hypotonisierung der Zellen erreicht, wodurch die Zelle anschwillt, die Kernmembran bricht, die interchromosomalen Bindungen aufbrechen und die Chromosomen frei im Zytoplasma schweben . Anschließend wird die resultierende Kultur mit einer Mischung aus Methanol und Essigsäure fixiert, zentrifugiert und das Fixiermittel gewechselt. Eine Suspension mit einem Fixiermittel wird auf einen sauberen Glasobjektträger aufgetragen, wo sich die Metaphasenplatte ausdehnt und sich darin getrennte Chromosomen befinden. Während das Fixiermittel trocknet, wird der Käfig fest mit dem Glas verbunden. Unabhängig von der Zellkultur, aus der Metaphasenplatten gewonnen wurden, gilt daher das allgemeine Prinzip für die Gewinnung von Präparaten: Anreicherung von Metaphasen, Hypotonisierung, Fixierung, Eingraben auf einen Objektträger.

Die Farbe der Droge. Die Färbevorbereitung ist der nächste Schritt nach der Gewinnung von Metaphasenplatten und wird in einfache, differenzierte und fluoreszierende unterteilt. Jede Art der Färbung wird verwendet, um nur bestimmte Veränderungen im Karyotyp zu erkennen. Bei einfacher Färbung (Giemsa-Färbemethode) ist nur eine Gruppenidentifizierung von Chromosomen möglich, daher wird diese Methode zur ungefähren Bestimmung numerischer Karyotypanomalien verwendet. Einfache Färbung wird häufig zur Untersuchung der chromosomalen Mutagenese verwendet, wenn Umweltfaktoren auf Mutation getestet werden. Die Giemsa-Färbung färbt alle Chromosomen gleichmäßig über die gesamte Länge und konturiert dabei das Zentromer, die Satelliten und sekundäre Verengungen. Die differenzielle Färbung beruht auf der Fähigkeit zur selektiven Färbung entlang der Länge und wird durch relativ einfache Temperatur-Salz-Effekte auf fixierte Chromosomen erzielt. In diesem Fall wird die strukturelle Differenzierung der Chromosomen entlang der Länge sichtbar, die sich als Wechsel von eu- und heterochromatischen Regionen (dunkel und hell) ausdrückt, die für jedes Chromosom, den entsprechenden Arm und die entsprechende Region spezifisch sind. Die am häufigsten verwendete G-Färbung. Dabei werden die Chromosomen mit einer Protease oder Kochsalzlösung vorbehandelt. Um den Mutationsprozess beim Menschen zu untersuchen, wird häufig die Methode der Differenzialfärbung von Schwesterchromatiden verwendet, die auf der Fähigkeit basiert, in die Replikationssequenz des Thymidin-Analogon-5-Bromdeoxyuridin-Chromosoms einbezogen zu werden. Chromosomenregionen, die dieses Analogon enthalten, färben sich schlecht, sodass mit dieser Methode jedes Chromosom oder jede chromosomale Neuanordnung identifiziert werden kann.

Untersuchung des Sexualchromatins. Die Methode zur Bestimmung des Geschlechtschromatins ist schneller und einfacher als die Untersuchung eines Chromosomensatzes (Karyotyp) und wird daher als einer der Screening-Tests für Massenbefragungen der Bevölkerung verwendet. Normalerweise bildet sich in den Zellen des weiblichen Körpers bei bestimmten Färbemethoden ein intensiv gefärbter Körper in der Nähe der Kernmembran – Sexualchromatin oder Barr-Körper, der aus einem inaktiven X-Chromosom besteht. Das andere X-Chromosom in den Zellen des weiblichen Körpers ist aktiv. Bei Männern gibt es nur ein X-Chromosom und es ist immer aktiv, daher wird das Geschlechtschromatin nicht in den Zellkernen des männlichen Körpers bestimmt. Zur Untersuchung des Sexualchromatins X wird üblicherweise ein Abstrich der Mundschleimhaut entnommen. Die gebräuchlichste Express-Färbemethode nach Sanders ist die Verwendung einer 2 %igen Essigsäure-Acetoorcein-Lösung mit anschließender Immersionsmikroskopie. Darüber hinaus wird das sogenannte Trommelfell auch in reifen Blutneutrophilen nachgewiesen, und die Körper von Chromatin und Trommelfell sind um eins kleiner als die Anzahl der X-Chromosomen. Bei Neutrophilen bei Männern werden auch perinukleäre Formationen in Form von „Fäden“ und „Haaren“ nachgewiesen. Das Verschwinden des inaktiven X-Chromosoms bei Frauen führt zum Fehlen des Geschlechtschromatins. Das Auftreten eines zusätzlichen X-Chromosoms bei einem Mann führt zur Bildung eines Körpers aus Geschlechtschromatin.

Indikationen zur zytogenetischen Untersuchung des Patienten:

• 1) multiple Fehlbildungen (drei oder mehr Systeme betreffend); die nachhaltigsten Störungen sind Fehlbildungen des Gehirns, des Bewegungsapparates, des Herzens und des Urogenitalsystems;
• 2) geistige Behinderung in Kombination mit körperlichen Entwicklungsstörungen, Dysplasie, Hypogenitalismus;
• 3) anhaltende primäre Unfruchtbarkeit bei Männern und Frauen unter Ausschluss gynäkologischer und urologischer Pathologie;
• 4) gewohnheitsmäßige Fehlgeburten, insbesondere im Frühstadium;
• 5) Verletzung der sexuellen Entwicklung (Hypogonadismus, sexuelle Inversionen);
• 6) ein geringes Gewicht eines Kindes, das während der Vollschwangerschaft geboren wurde.

Der Einsatz der zytogenetischen Methode in der klinischen Genetik hat zur Entwicklung einer neuen Richtung geführt – der klinischen Zytogenetik, die Folgendes ermöglicht:

• - den Ursprung strukturell neu angeordneter Chromosomen und ihre genaue Klassifizierung feststellen;
• - Syndrome identifizieren, die durch ein Ungleichgewicht in den Regionen einzelner Chromosomen verursacht werden;
• - um Informationen über Chromosomenveränderungen in Tumorzellen, bei Patienten mit erblichen Blutkrankheiten usw. zu sammeln.

Grundlage der Methode ist die mikroskopische Untersuchung des Chromosoms. Zytologische Studien sind seit den frühen 1920er Jahren weit verbreitet. zwanzigstes Jahrhundert. die Morphologie der Chromosomen zu untersuchen, Kultivierung von Leukozyten zur Gewinnung von Metaphaseplatten.

Die Entwicklung der modernen Zytogenetik des Menschen ist mit den Namen der Zytologen D. Tio und A. Levan verbunden. 1956 stellten sie als erste fest, dass der Mensch 46 Chromosomen hat, was den Beginn einer umfassenden Untersuchung mitotischer und meiotischer menschlicher Chromosomen markierte.

Im Jahr 1959 stellten die französischen Wissenschaftler D. Lejeune, R. Turpin und M. Gauthier die chromosomale Natur der Down-Krankheit fest. In den Folgejahren wurden viele weitere chromosomale Syndrome beschrieben, die beim Menschen häufig vorkommen. Die Zytogenetik ist zu einem wichtigen Zweig der praktischen Medizin geworden. Derzeit wird die zytogenetische Methode zur Diagnose von Chromosomenerkrankungen, zur Erstellung genetischer Karten von Chromosomen, zur Untersuchung des Mutationsprozesses und anderen Problemen der Humangenetik eingesetzt.

1960 wurde in Denver die erste internationale Klassifikation menschlicher Chromosomen entwickelt. Sie basierte auf der Größe der Chromosomen und der Position der primären Verengung – dem Zentromer. Alle Chromosomen sind in ihrer Form in methozentrische, submetazentrische und akrozentrische Chromosomen unterteilt und in 7 Gruppen unterteilt, die mit den lateinischen Buchstaben A, B, C, D, E, F, G bezeichnet werden. Jedes Chromosomenpaar war mit einer Seriennummer von 1 bis 22 ausgestattet , getrennt getrennt und mit lateinischen Buchstaben benannt - X- und Y-Geschlechtschromosomen.

Im Jahr 1971 wurden auf der Prager Genetikerkonferenz zusätzlich zur Denver-Klassifikation Methoden zur differenziellen Färbung von Chromosomen vorgestellt, dank derer jedes Chromosom sein eigenes einzigartiges Muster erhält, das bei der genauen Identifizierung hilft.

Grundlegende Informationen über die Morphologie menschlicher Chromosomen wurden durch ihre Untersuchung in den Metaphasen der Mitose und Prophase – der Metaphase der Meiose – gewonnen. Wichtig ist, dass die Zahl der sich teilenden Zellen hoch war. Die wichtigsten zytogenetischen Arbeiten wurden an Lymphozyten des peripheren Blutes durchgeführt, da die Kultivierung von Lymphozyten über 2-3 Tage in Gegenwart von Phytohämagglutinin die Gewinnung von Metaphasenplatten für die Chromosomenanalyse ermöglicht.

Der zytogenetischen Analyse werden einschichtige Metaphasenplatten mit getrennten Chromosomen unterzogen. Dazu werden sich teilende Zellen mit Colchicin und einigen Chemikalien behandelt.

Ein wichtiger Schritt in der zytogenetischen Analyse ist die Färbung der gewonnenen Präparate. Es wird mit einfachen Differential- und Fluoreszenzmethoden durchgeführt.

Fortschritte in der molekularen Zytogenetik des Menschen ermöglichen die Entwicklung neuer Methoden zur Untersuchung von Chromosomen. Hervorzuheben ist daher die Methode der Fluoreszenzhybridisierung, die es ermöglicht, ein breites Spektrum an Fragestellungen zu untersuchen: von der Genlokalisierung bis zur Entschlüsselung komplexer Umlagerungen zwischen mehreren Chromosomen.

Durch die Kombination zytogenetischer und molekulargenetischer Methoden in der Humangenetik sind die Möglichkeiten zur Diagnose von Chromosomenanomalien nahezu unbegrenzt.

Die Zytogenetik ist ein Zweig der Genetik, der die Muster der Vererbung und Variabilität auf der Ebene von Zellen und subzellulären Strukturen, hauptsächlich Chromosomen, untersucht. Zytogenetische Methoden dienen der Untersuchung der Struktur des Chromosomensatzes oder einzelner Chromosomen. Grundlage zytogenetischer Methoden ist die mikroskopische Untersuchung menschlicher Chromosomen. Mikroskopische Methoden zur Untersuchung menschlicher Chromosomen wurden Ende des 19. Jahrhunderts eingesetzt. Der Begriff „Zytogenetik“ wurde 1903 von William Sutton eingeführt.

Zytogenetische Studien werden seit den frühen 1920er Jahren häufig eingesetzt. 20. Jahrhundert zur Untersuchung der Morphologie menschlicher Chromosomen, zur Chromosomenzählung und zur Kultivierung von Leukozyten zur Gewinnung von Metaphasenplatten. Im Jahr 1959 stellten die französischen Wissenschaftler D. Lejeune, R. Turpin und M. Gauthier die chromosomale Natur der Down-Krankheit fest. In den Folgejahren wurden viele weitere chromosomale Syndrome beschrieben, die beim Menschen häufig vorkommen. 1960 stellten R. Moorhead et al. entwickelte eine Methode zur Kultivierung peripherer Blutlymphozyten, um menschliche Metaphase-Chromosomen zu erhalten, die es ermöglichte, Chromosomenmutationen nachzuweisen, die für bestimmte Erbkrankheiten charakteristisch sind.

Der Einsatz zytogenetischer Methoden: die Untersuchung eines normalen menschlichen Karyotyps, die Diagnose von Erbkrankheiten im Zusammenhang mit genomischen und chromosomalen Mutationen, die Untersuchung der mutagenen Wirkung verschiedener Chemikalien, Pestizide, Insektizide, Medikamente usw. Der Gegenstand zytogenetischer Studien kann sein Sie teilen somatische, meiotische und Interphase-Zellen.

ZYTOGENETISCHE METHODEN Lichtmikroskopie Elektronenmikroskopie Konfokale Mikroskopie Fluoreszenzmikroskopie Fluoreszenzmikroskopie

Indikationen für zytogenetische Untersuchungen. Verdacht auf eine Chromosomenerkrankung aufgrund klinischer Symptome (zur Bestätigung der Diagnose). Das Vorliegen mehrerer angeborener Fehlbildungen beim Kind, die nicht mit dem Gensyndrom und der körperlichen Entwicklung des Kindes zusammenhängen

Pränatale Diagnose (nach Alter, aufgrund des Vorliegens einer Translokation bei den Eltern, bei der Geburt eines früheren Kindes mit einer Chromosomenerkrankung) Verdacht auf Syndrome, die durch Chromosomeninstabilität gekennzeichnet sind Leukämie (zur Differentialdiagnose, Beurteilung der Wirksamkeit der Behandlung und Prognose von Behandlung) Bewertung der mutagenen Wirkung verschiedener Chemikalien, Pestizide, Insektizide, Medikamente usw.

Während der Zellteilung im Metaphasestadium weisen die Chromosomen eine klarere Struktur auf und stehen für Studien zur Verfügung. Üblicherweise werden menschliche periphere Blutleukozyten untersucht, die in ein spezielles Nährmedium gegeben werden und sich dort teilen. Anschließend werden Präparate vorbereitet und die Anzahl und Struktur der Chromosomen analysiert.

Zytogenetische Untersuchungen somatischer Zellen Gewinnung von Präparaten mitotischer Chromosomen Färbung von Präparaten (einfach, differenziell und fluoreszierend) Molekulare zytogenetische Methoden – Farb-in-situ-Hybridisierungsmethode (FISH)

Zu den in der klinischen Praxis verwendeten zytogenetischen Methoden gehören: - klassische Methoden der Karyotypisierung; - molekularzytogenetische Methoden. Bis vor kurzem basierte die Diagnose chromosomaler Erkrankungen auf der Verwendung traditioneller Methoden der zytogenetischen Analyse.

Für die Untersuchung von Chromosomen werden am häufigsten Präparate einer Kurzzeitblutkultur sowie Knochenmarkszellen und Fibroblastenkulturen verwendet. Blut mit einem Antikoagulans wird zentrifugiert, um Erythrozyten auszufällen, und Leukozyten werden 2–3 Tage lang in einem Kulturmedium inkubiert. Der Blutprobe wird Phytohämagglutinin zugesetzt, da es die Agglutination der roten Blutkörperchen beschleunigt und die Teilung der Lymphozyten anregt. Die am besten geeignete Phase für die Untersuchung von Chromosomen ist die Metaphase der Mitose. Daher wird Colchicin verwendet, um die Teilung der Lymphozyten in diesem Stadium zu stoppen. Die Zugabe dieses Arzneimittels zur Kultur führt zu einer Erhöhung des Anteils der Zellen, die sich in der Metaphase befinden, also in dem Stadium des Zellzyklus, in dem die Chromosomen am besten sichtbar sind. Jedes Chromosom repliziert sich und wird nach entsprechender Färbung als zwei am Zentromer oder an der zentralen Verengung befestigte Chromatiden erkannt. Anschließend werden die Zellen mit einer hypotonischen Natriumchloridlösung behandelt, fixiert und gefärbt. Chromosomen werden häufig mit Romanovsky-Giemsa-Färbung, 2 % Acetcarmin oder 2 % Acetarsein gefärbt. Sie färben ganze Chromosomen gleichmäßig (Routinemethode) und können zur Erkennung numerischer Chromosomenanomalien verwendet werden.

Denver-Klassifikation menschlicher Chromosomen (1960). Gruppe A (1-3) – drei Paare der größten Chromosomen: zwei metazentrische und 1 submetazentrische. Gruppe B – (4-5) – zwei Paare langer submetazentrischer Chromosomen. Gruppe C (6–12) – 7 Paare mittelgroßer submetazentrischer Autosomen und ein X-Chromosom. Gruppe D (13-15) – drei Paare mittelakrozentrischer Chromosomen. Gruppe E (16–18) – drei Paare metazentrischer und submetazentrischer Chromosomen. Gruppe F (19-20) – zwei Paare kleiner metazentrischer Chromosomen. Gruppe G (21-22 und Y) – zwei Paare kleiner akrozentrischer Chromosomen und ein Y-Chromosom.

1. Routinemäßige (einheitliche) Färbung. 2. Wird verwendet, um die Anzahl der Chromosomen zu analysieren und strukturelle Störungen (Aberrationen) zu identifizieren. Bei der Routinefärbung kann nur eine Gruppe von Chromosomen zuverlässig identifiziert werden, bei der Differentialfärbung alle Chromosomen

Idiogramm menschlicher Chromosomen gemäß den Klassifikationen von Denver und Paris A B C E D F G

Methoden der Differenzialfärbung der Chromosomen Q-Färbung – Kaspersson-Färbung mit Acrichiniprit mit Untersuchung unter einem Fluoreszenzmikroskop. Wird am häufigsten zur Untersuchung von Y-Chromosomen verwendet. G-Färbung – modifizierte Färbung nach Romanovsky – Giemsa. Die Empfindlichkeit ist höher als die der Q-Färbung und wird daher als Standardmethode für die zytogenetische Analyse verwendet. Wird verwendet, um kleine Aberrationen und Markerchromosomen (anders segmentiert als normale homologe Chromosomen) zu erkennen. R-Färbung – Acridinorange und ähnliche Farbstoffe werden verwendet, während Abschnitte von Chromosomen gefärbt werden, die gegenüber G-Färbung unempfindlich sind. C-Färbung – wird zur Analyse der zentromeren Regionen von Chromosomen verwendet, die konstitutives Heterochromatin enthalten. T-Färbung – wird zur Analyse der Telomerregionen von Chromosomen verwendet.

Bereiche mit starker und schwacher Kondensation entlang der Länge des Chromosoms sind für jedes Chromosom spezifisch und weisen unterschiedliche Farbintensitäten auf.

Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine spektrale Karyotypisierung, bei der Chromosomen mit einer Reihe von Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt werden, die an bestimmte Chromosomenregionen binden. Durch eine solche Färbung erhalten homologe Chromosomenpaare identische spektrale Eigenschaften, was die Identifizierung solcher Paare und den Nachweis interchromosomaler Translokationen, also Bewegungen von Abschnitten zwischen Chromosomen, erheblich erleichtert – translozierte Abschnitte haben ein vom Spektrum abweichendes Spektrum des restlichen Chromosoms.

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung oder FISH-Methode ist eine zytogenetische Methode, mit der die Position einer bestimmten DNA-Sequenz auf Metaphase-Chromosomen oder in Interphase-Kernen in situ nachgewiesen und bestimmt wird. Bei der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung werden DNA-Sonden (DNA-Sonden) verwendet, die an komplementäre Ziele in der Probe binden. DNA-Sonden enthalten Nukleoside, die mit Fluorophoren (direkte Markierung) oder Konjugaten wie Biotin oder Digoxigenin (indirekte Markierung) markiert sind.

Bestimmung der Translokation t (9; 22) (q 34; q 11) bei chronischer myeloischer Leukämie mit der FISH-Methode, das ABL 1-Gen (Chromosom 9) verbindet sich mit dem BCR-Gen (Chromosom 22) – einem chimären BCR-ABL 1-Gen Es entsteht eine Metaphasenplatte mit dem Philadelphia-Chromosom. Chromosomen sind blau gefärbt, der ABL 1-Locus ist rot und der BCR-Locus ist grün. Oben links - ein neu angeordnetes Chromosom, markiert mit einem rot-grünen Punkt.

Bei der mehrfarbigen FISH handelt es sich um eine spektrale Karyotypisierung, bei der Chromosomen mit einer Reihe fluoreszierender Farbstoffe gefärbt werden, die an bestimmte Chromosomenregionen binden. Durch eine solche Färbung erhalten homologe Chromosomenpaare identische spektrale Eigenschaften, was die Identifizierung solcher Paare und den Nachweis interchromosomaler Translokationen, also Bewegungen von Abschnitten zwischen Chromosomen, erheblich erleichtert – translozierte Abschnitte haben ein vom Spektrum abweichendes Spektrum des restlichen Chromosoms.

Karyotyp 46, XY, t(1; 3)(p 21; q 21), del(9)(q 22) Translokation zwischen dem 1. und 3. Chromosom, Deletion des 9. Chromosoms. Die Markierung von Chromosomenregionen erfolgt sowohl durch Komplexe von Quermarkierungen (klassische Karyotypisierung, Streifen) als auch durch das Fluoreszenzspektrum (Farbe, spektrale Karyotypisierung).