Σπίτι › Κινητήρας › Μελέτες κυτταρογενετικής μεθόδου. Γενετικές μέθοδοι

Μελέτες κυτταρογενετικής μεθόδου. Γενετικές μέθοδοι

Κυτταρογενετικές (καρυοτυπικές, καρυοτυπικές) μέθοδοιχρησιμοποιούνται κυρίως στη μελέτη καρυοτύπων μεμονωμένων ατόμων.

Η ουσία αυτής της μεθόδου είναι να μελετήσει τη δομή μεμονωμένων χρωμοσωμάτων, καθώς και τα χαρακτηριστικά του συνόλου των χρωμοσωμάτων των ανθρώπινων κυττάρων σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις. Λεμφοκύτταρα, στοματικά επιθηλιακά κύτταρα και άλλα κύτταρα που είναι εύκολο να ληφθούν, να καλλιεργηθούν και να υποβληθούν σε καρυολογική ανάλυση χρησιμεύουν ως βολικό αντικείμενο για αυτό. Αυτή είναι μια σημαντική μέθοδος για τον προσδιορισμό του φύλου και των χρωμοσωμικών κληρονομικών ασθενειών ενός ατόμου.

Η βάση της κυτταρογενετικής μεθόδου είναι η μελέτη της μορφολογίας μεμονωμένων χρωμοσωμάτων των ανθρώπινων κυττάρων. Το σύγχρονο στάδιο κατανόησης της δομής των χρωμοσωμάτων χαρακτηρίζεται από τη δημιουργία μοριακών μοντέλων αυτών των πιο σημαντικών δομών του πυρήνα, τη μελέτη του ρόλου των επιμέρους συστατικών των χρωμοσωμάτων στην αποθήκευση και μετάδοση κληρονομικών πληροφοριών.

Οι αλλαγές στον καρυότυπο συνήθως συνδέονται με την ανάπτυξη γενετικών ασθενειών. Χάρη στην καλλιέργεια ανθρώπινων κυττάρων, είναι δυνατό να ληφθεί γρήγορα ένα αρκετά μεγάλο υλικό για την παρασκευή παρασκευασμάτων. Για τον καρυότυπο, χρησιμοποιείται συνήθως μια βραχυπρόθεσμη καλλιέργεια λευκοκυττάρων του περιφερικού αίματος.

Οι κυτταρογενετικές μέθοδοι χρησιμοποιούνται επίσης για την περιγραφή των ενδοφασικών κυττάρων. Για παράδειγμα, με την παρουσία ή την απουσία φυλετικής χρωματίνης (σώματα Barr, τα οποία είναι αδρανοποιημένα χρωμοσώματα Χ), είναι δυνατό όχι μόνο να προσδιοριστεί το φύλο των ατόμων, αλλά και να εντοπιστούν ορισμένες γενετικές ασθένειες που σχετίζονται με μια αλλαγή στον αριθμό των Χ χρωμοσώματα.

Η μέθοδος σας επιτρέπει να αναγνωρίσετε τον καρυότυπο (δομικά χαρακτηριστικά και αριθμό χρωμοσωμάτων) καταγράφοντας ένα καρυόγραμμα. Πραγματοποιείται κυτταρογενετική μελέτη στον ανίατο, τους γονείς, τους συγγενείς ή το έμβρυο εάν υπάρχει υποψία για χρωμοσωμικό σύνδρομο ή άλλη χρωμοσωμική διαταραχή.

Καρυότυπος- κυτταρογενετική μέθοδος - επιτρέπει τον εντοπισμό αποκλίσεων στη δομή και τον αριθμό των χρωμοσωμάτων που μπορούν να προκαλέσουν στειρότητα, άλλες κληρονομικές ασθένειες και τη γέννηση ενός άρρωστου παιδιού.

Στην ιατρική γενετική, δύο κύριοι τύποι καρυότυπου είναι σχετικοί:

μελέτη του καρυότυπου των ασθενών
προγεννητικός καρυότυπος - εξέταση εμβρυϊκών χρωμοσωμάτων

Κυτταρογενετική μέθοδος για τη μελέτη της ανθρώπινης γενετικής. Προσδιορισμός Χ- και Υ-χρωματίνης. Η αξία της μεθόδου για τη διάγνωση χρωμοσωμικών ασθενειών που σχετίζονται με ανωμαλίες στον αριθμό των φυλετικών χρωμοσωμάτων στον καρυότυπο.

Προσδιορισμός Χ- και Υ-χρωματίνηςαναφέρεται συχνά ως μέθοδος ταχείας διάγνωσης σεξ. Εξετάστε τα κύτταρα της βλεννογόνου μεμβράνης της στοματικής κοιλότητας, του κολπικού επιθηλίου ή των τριχοθυλακίων. Στους πυρήνες των θηλυκών κυττάρων στο διπλοειδές σύνολο, υπάρχουν δύο χρωμοσώματα Χ, ένα από τα οποία είναι εντελώς αδρανοποιημένο (σπειροειδές, πυκνά συσσωρευμένο) ήδη στα αρχικά στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης και είναι ορατό ως ένα κομμάτι ετεροχρωματίνης που συνδέεται με την πυρηνική μεμβράνη. . Ένα απενεργοποιημένο χρωμόσωμα Χ ονομάζεται φυλετική χρωματίνη ή σώμα του Barr. Για την ανίχνευση της φυλετικής χρωματίνης Χ (σώματα Barr) στους κυτταρικούς πυρήνες, τα επιχρίσματα βάφονται με ακεταρσεΐνη και τα παρασκευάσματα εξετάζονται χρησιμοποιώντας ένα συμβατικό μικροσκόπιο φωτός. Κανονικά, οι γυναίκες έχουν μια δέσμη Χ-χρωματίνης, ενώ οι άνδρες όχι.

Για τον εντοπισμό της αρσενικής χρωματίνης Υ-φύλου (σώμα F), τα επιχρίσματα χρωματίζονται με κινακρίνη και παρατηρούνται χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού. Η Υ-χρωματίνη αποκαλύπτεται με τη μορφή μιας έντονα φωτεινής κουκκίδας, η οποία διαφέρει ως προς το μέγεθος και την ένταση της φωταύγειας από τα υπόλοιπα χρωμοκέντρα. Βρίσκεται στους πυρήνες των κυττάρων του ανδρικού σώματος.

Η απουσία σώματος Barr στις γυναίκες υποδηλώνει χρωμοσωμική νόσο - σύνδρομο Shereshevsky-Turner (καρυότυπος 45, Χ0). Η παρουσία ενός σώματος Barr στους άνδρες υποδηλώνει σύνδρομο Klinefelter (καρυότυπος 47, XXY).

Ο προσδιορισμός της Χ- και Υ-χρωματίνης είναι μια μέθοδος διαλογής, η τελική διάγνωση της χρωμοσωμικής νόσου γίνεται μόνο μετά τη μελέτη του καρυότυπου.

Κυτταρογενετική μέθοδος

Η κυτταρογενετική μέθοδος χρησιμοποιείται για τη μελέτη του φυσιολογικού καρυότυπου του ανθρώπου, καθώς και για τη διάγνωση κληρονομικών ασθενειών που σχετίζονται με γονιδιωματικές και χρωμοσωμικές μεταλλάξεις.
Επιπλέον, η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται στη μελέτη της μεταλλαξογόνου δράσης διαφόρων χημικών ουσιών, φυτοφαρμάκων, εντομοκτόνων, φαρμάκων κ.λπ.
Κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης στο στάδιο της μετάφασης, τα χρωμοσώματα έχουν πιο ξεκάθαρη δομή και είναι διαθέσιμα για μελέτη. Το ανθρώπινο διπλοειδές σύνολο αποτελείται από 46 χρωμοσώματα:
22 ζεύγη αυτοσωμάτων και ένα ζευγάρι φυλετικών χρωμοσωμάτων (XX στις γυναίκες, XY στους άνδρες). Συνήθως εξετάζονται τα ανθρώπινα λευκοκύτταρα περιφερικού αίματος, τα οποία τοποθετούνται σε ειδικό θρεπτικό μέσο, όπου διαιρούνται. Στη συνέχεια παρασκευάζονται σκευάσματα και αναλύεται ο αριθμός και η δομή των χρωμοσωμάτων. Η ανάπτυξη ειδικών μεθόδων χρώσης έχει απλοποιήσει πολύ την αναγνώριση όλων των ανθρώπινων χρωμοσωμάτων και σε συνδυασμό με τη γενεαλογική μέθοδο και μεθόδους κυτταρικής και γενετικής μηχανικής, κατέστησε δυνατή τη συσχέτιση γονιδίων με συγκεκριμένες περιοχές χρωμοσωμάτων. Η πολύπλοκη εφαρμογή αυτών των μεθόδων αποτελεί τη βάση της χαρτογράφησης των ανθρώπινων χρωμοσωμάτων.

Ο κυτταρολογικός έλεγχος είναι απαραίτητος για τη διάγνωση χρωμοσωμικών ασθενειών που σχετίζονται με ανυπλοειδία και χρωμοσωμικές μεταλλάξεις. Οι πιο συχνές είναι η νόσος Down (τρισωμία στο 21ο χρωμόσωμα), το σύνδρομο Klinefelter (47 XXY), το σύνδρομο Shershevsky-Turner (45 XO) κ.λπ. Η απώλεια ενός τμήματος ενός από τα ομόλογα χρωμοσώματα του 21ου ζεύγους οδηγεί σε αίμα ασθένεια - χρόνια μυελογενή λευχαιμία.

Κυτταρολογικές μελέτες των μεσοφασικών πυρήνων των σωματικών κυττάρων μπορούν να αποκαλύψουν το λεγόμενο σώμα Barr ή φυλετική χρωματίνη. Αποδείχθηκε ότι η φυλετική χρωματίνη είναι κανονικά παρούσα στις γυναίκες και απουσιάζει στους άνδρες. Είναι το αποτέλεσμα της ετεροχρωματοποίησης ενός από τα δύο χρωμοσώματα Χ στις γυναίκες. Γνωρίζοντας αυτό το χαρακτηριστικό, είναι δυνατό να προσδιοριστεί το φύλο και να εντοπιστεί ένας μη φυσιολογικός αριθμός χρωμοσωμάτων Χ.

Η ανίχνευση πολλών κληρονομικών ασθενειών είναι δυνατή ακόμη και πριν από τη γέννηση ενός παιδιού. Η μέθοδος της προγεννητικής διάγνωσης συνίσταται στη λήψη αμνιακού υγρού, όπου βρίσκονται τα κύτταρα του εμβρύου, και στον μετέπειτα βιοχημικό και κυτταρολογικό προσδιορισμό πιθανών κληρονομικών ανωμαλιών. Αυτό σας επιτρέπει να κάνετε μια διάγνωση στα αρχικά στάδια της εγκυμοσύνης και να αποφασίσετε αν θα τη συνεχίσετε ή θα τη διακόψετε.

Η κυτταρογενετική είναι ένας ανεξάρτητος κλάδος της μελέτης της κληρονομικότητας, ο οποίος μελετά διάφορους, κυρίως παρατηρήσιμους (εξηγούμενους) φορείς που περιέχουν πληροφορίες για τη γενετική κληρονομικότητα. Τέτοιοι φορείς είναι χρωμοσώματα διαφόρων τύπων (πολυτένιο, μιτωτικό και μειοτικό), πλαστίδια, πυρήνες ενδιάμεσης φάσης και, σε μικρότερο βαθμό, μιτοχόνδρια.

Κατόπιν αυτού, η κυτταρογενετική μέθοδος είναι ένα σύνολο μεθόδων και τεχνολογιών για τη μελέτη, πρώτα απ 'όλα, των χρωμοσωμάτων, κατά την οποία καθορίζεται η ποσοτική τους παράμετρος, γίνεται η χημική και βιολογική τους περιγραφή, μελετάται η δομή και οι τρόποι συμπεριφοράς κατά τη διαίρεση των κυττάρων. . Το επιστημονικό καθήκον αυτής της μελέτης είναι να δημιουργήσει μια σχέση μεταξύ της φύσης και της δυναμικής των αλλαγών στη δομή των χρωμοσωμάτων και μιας εικόνας που αντανακλά τη μεταβλητότητα των χαρακτήρων.

Ένας από τους σημαντικότερους τομείς έρευνας, που περιλαμβάνει την κυτταρογενετική μέθοδο, είναι η ανάλυση του ανθρώπινου καρυότυπου. Αυτή η μελέτη, κατά κανόνα, διεξάγεται σε καλλιέργειες στις οποίες λαμβάνει χώρα η διαίρεση των γεννητικών και σωματικών κυττάρων.

Η πιο κοινή καλλιέργεια για αυτό το είδος έρευνας είναι τα κύτταρα του περιφερικού αίματος όπως τα λεμφοκύτταρα, οι ινοβλάστες και τα κύτταρα του μυελού των οστών. Η πιο προσιτή καλλιέργεια που χρησιμοποιείται στην ιατρική κυτταρογενετική είναι τα λεμφοκύτταρα του αίματος. Ο λόγος για αυτό είναι ότι, κατά κανόνα, αποτελούν αντικείμενο ανάλυσης και στην περίπτωση του εμβρύου, η κυτταρογενετική μέθοδος περιλαμβάνει τη χρήση κυτταροκαλλιεργειών, η επιλογή των οποίων καθορίζεται από μια σειρά παραγόντων. Το κυριότερο είναι η ηλικία κύησης. Για παράδειγμα, σε αυτή την περίοδο μικρότερη των 12 εβδομάδων, η κυτταρογενετική ανάλυση των χρωμοσωμάτων γίνεται καλύτερα με τη συμμετοχή των κυττάρων του χορίου και σε ηλικίες κύησης άνω των 12 εβδομάδων, είναι σκόπιμο να ληφθούν υπόψη τα κύτταρα του ίδιου του εμβρύου για έρευνα. Για το σκοπό αυτό, απομονώνονται ειδικά από τον πλακούντα και το εμβρυϊκό αίμα.

Για την καθιέρωση ενός καρυότυπου, η κυτταρογενετική κληρονομικότητα απαιτεί τη λήψη δείγματος αίματος σε ποσότητα τουλάχιστον 1-2 ml. Ταυτόχρονα, η ίδια η μέθοδος περιλαμβάνει τη διεξαγωγή μιας μελέτης που αποτελείται από τρία κύρια στάδια:

Απομόνωση και επί του οποίου θα πραγματοποιηθεί η ανάλυση.

Το χρώμα του φαρμάκου.

Διεξαγωγή ενδελεχούς ανάλυσης του φαρμάκου κάτω από μικροσκόπιο.

Η κυτταρογενετική μέθοδος της γενετικής μπορεί να είναι αποτελεσματική μόνο όταν πληρούνται οι ακόλουθες προϋποθέσεις. Πρώτον, πρέπει να υπάρχει ένας ορισμένος αριθμός κυττάρων στο στάδιο της μετάφασης. Δεύτερον, η καλλιέργεια πρέπει να διεξάγεται αυστηρά σύμφωνα με τους καθιερωμένους κανόνες και για περίοδο τουλάχιστον 72 ωρών. Τρίτον, η στερέωση των κυττάρων πρέπει να πραγματοποιείται με διάλυμα και μεθανόλη σε αυστηρή αναλογία αυτών των ουσιών 3: 1.

Στο στάδιο της χρώσης, η προετοιμασία για την επιλογή των χρωμάτων γίνεται λαμβάνοντας υπόψη τον ίδιο τον σκοπό της μελέτης, δηλαδή το είδος των ανακατατάξεων που πρέπει να μελετηθούν. Τις περισσότερες φορές χρησιμοποιείται η μέθοδος της συνεχούς χρώσης, καθώς είναι η απλούστερη για τον προσδιορισμό της ποσοτικής παραμέτρου των χρωμοσωμάτων. Η σύγχρονη έρευνα χρησιμοποιεί κυρίως αυτή τη μέθοδο χρώσης για να προσδιορίσει τις ανωμαλίες του καρυότυπου στην ποσοτική τους έκφραση. Αλλά μια τέτοια κυτταρογενετική μέθοδος δεν καθιστά δυνατό τον προσδιορισμό και την αποκάλυψη της δομικής δυναμικής των χρωμοσωμάτων. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιούνται άλλες, ειδικές μέθοδοι που επιτρέπουν την ισοπέδωση αυτού του μειονεκτήματος της μεθόδου συνεχούς χρώσης. Τα πιο συνηθισμένα από αυτά, όπως η μέθοδος διαφοροποιημένου χρωματισμού, η μέθοδος G, η μέθοδος R και άλλες.

Και, τέλος, το τρίτο στάδιο της μελέτης συνίσταται στη μικροσκοπική μελέτη χρωματισμένων χρωμοσωμάτων που βρίσκονται στο στάδιο της μετάφασης. Στην πορεία του διαπιστώνεται ο αριθμός των φυσιολογικών και μη φυσιολογικών κυττάρων του ανθρώπινου εμβρυϊκού σώματος. Για αυτό, κατά κανόνα, πραγματοποιείται ανάλυση αρκετών ιστών.

Για τον προσδιορισμό του καρυότυπου χρησιμοποιούνται τόσο άμεσες όσο και έμμεσες μέθοδοι έρευνας. Στην πρώτη περίπτωση, το υλικό που λαμβάνεται από μυελό των οστών, λεμφαδένες, εμβρυϊκούς ιστούς, χόριο, κύτταρα αμνιακού υγρού ή άλλους ιστούς μελετάται αμέσως μετά τη λήψη. Ωστόσο, η άμεση μέθοδος είναι ενημερωτική μόνο όταν υπάρχει επαρκής αριθμός μιτωτικών μεταφάσεων στο υλικό, αφού μόνο σε αυτή τη φάση τα χρωμοσώματα αποκτούν τα εγγενή δομικά χαρακτηριστικά τους και είναι δυνατή η ακριβής ταυτοποίησή τους. Επί του παρόντος, χρησιμοποιούνται ευρέως έμμεσες μέθοδοι έρευνας.

Μέθοδος παρασκευής πλακών μεταφάσης. Η ληφθείσα καλλιέργεια (λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος κ.λπ.) τοποθετείται σε θρεπτικό υλικό για καλλιέργεια. Κανονικά, η μίτωση των λεμφοκυττάρων δεν παρατηρείται στο περιφερικό αίμα, επομένως, χρησιμοποιούνται φάρμακα (φυτοαιμοσυγκολλητίνη) που διεγείρουν τον ανοσολογικό μετασχηματισμό των λεμφοκυττάρων και τη διαίρεση τους. Το δεύτερο βήμα είναι να σταματήσει η μιτωτική κυτταρική διαίρεση στο στάδιο της μετάφασης. Αυτό επιτυγχάνεται με την προσθήκη κολχικίνης ή colcimed στην ιστοκαλλιέργεια 2-3 ώρες πριν από το τέλος της καλλιέργειας. Στο τρίτο στάδιο, χρησιμοποιώντας ένα υποτονικό διάλυμα χλωριούχου ασβεστίου ή κιτρικού νατρίου, επιτυγχάνεται υποτονοποίηση των κυττάρων, με αποτέλεσμα το κύτταρο να διογκώνεται, η πυρηνική μεμβράνη σπάει, οι διαχρωμοσωμικοί δεσμοί σπάνε και τα χρωμοσώματα να επιπλέουν ελεύθερα στο κυτταρόπλασμα. . Στη συνέχεια, η προκύπτουσα καλλιέργεια σταθεροποιείται με μίγμα μεθανόλης και οξικού οξέος, φυγοκεντρείται και αλλάζει το σταθεροποιητικό. Ένα εναιώρημα με σταθεροποιητικό εφαρμόζεται σε μια καθαρή γυάλινη πλάκα, όπου η πλάκα μετάφασης διαστέλλεται και χωριστά χρωμοσώματα βρίσκονται μέσα σε αυτήν. Καθώς το σταθεροποιητικό στεγνώνει, ο κλωβός στερεώνεται σταθερά στο γυαλί. Έτσι, ανεξάρτητα από την κυτταρική καλλιέργεια από την οποία ελήφθησαν οι πλάκες μετάφασης, η γενική αρχή για τη λήψη παρασκευασμάτων είναι η εξής: συσσώρευση μεταφάσεων, υποτονοποίηση, στερέωση, σκάψιμο σε γυάλινη πλάκα.

Το χρώμα του φαρμάκου. Τα παρασκευάσματα χρώσης είναι το επόμενο στάδιο μετά τη λήψη των πλακών μετάφασης και χωρίζονται σε απλές, διαφοροποιημένες και φθορίζουσες. Κάθε τύπος χρώσης χρησιμοποιείται για την ανίχνευση μόνο ορισμένων αλλαγών στον καρυότυπο. Με απλή χρώση (μέθοδος χρώσης Giemsa), είναι δυνατή μόνο η ομαδική ταυτοποίηση των χρωμοσωμάτων, επομένως αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται για τον κατά προσέγγιση προσδιορισμό των αριθμητικών ανωμαλιών καρυότυπου. Η απλή χρώση χρησιμοποιείται ευρέως για τη μελέτη της χρωμοσωμικής μεταλλαξιογένεσης κατά τον έλεγχο περιβαλλοντικών παραγόντων για μετάλλαξη. Η χρώση Giemsa λερώνει όλα τα χρωμοσώματα ομοιόμορφα σε όλο το μήκος, ενώ διαμορφώνει το περίγραμμα του κεντρομερούς, των δορυφόρων και των δευτερογενών συστολών. Η διαφορική χρώση οφείλεται στην ικανότητα επιλεκτικής χρώσης κατά μήκος και παρέχεται από σχετικά απλά αποτελέσματα θερμοκρασίας-άλατος σε σταθερά χρωμοσώματα. Στην περίπτωση αυτή, αποκαλύπτεται η δομική διαφοροποίηση των χρωμοσωμάτων κατά μήκος, η οποία εκφράζεται ως εναλλαγή ευ- και ετεροχρωματικών περιοχών (σκοτεινή και φωτεινή), που είναι ειδικές για κάθε χρωμόσωμα, τον αντίστοιχο βραχίονα και περιοχή. Η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη χρώση G. Σε αυτή την περίπτωση, τα χρωμοσώματα υποβάλλονται σε προεπεξεργασία με διάλυμα πρωτεάσης ή αλατούχου διαλύματος. Για τη μελέτη της διαδικασίας μετάλλαξης στον άνθρωπο, χρησιμοποιείται ευρέως η μέθοδος διαφορικής χρώσης αδελφών χρωματίδων, με βάση την ικανότητα να περιλαμβάνονται στην αλληλουχία αντιγραφής του χρωμοσώματος του αναλόγου θυμιδίνης-5-βρωμοδεοξυουριδίνης. Οι χρωμοσωμικές περιοχές που περιλαμβάνουν αυτήν την ανάλογη χρώση ελάχιστα, επομένως οποιαδήποτε χρωμοσωμική ή χρωμοσωμική αναδιάταξη μπορεί να αναγνωριστεί χρησιμοποιώντας αυτήν τη μέθοδο.

Μελέτη της φυλετικής χρωματίνης. Η μέθοδος προσδιορισμού της χρωματίνης φύλου είναι ταχύτερη και απλούστερη από τη μελέτη ενός συνόλου χρωμοσωμάτων (καρυότυπος), επομένως χρησιμοποιείται ως ένα από τα τεστ διαλογής για μαζικές έρευνες του πληθυσμού. Κανονικά, στα κύτταρα του γυναικείου σώματος, με ορισμένες μεθόδους χρώσης, σχηματίζεται ένα έντονα χρωματισμένο σώμα κοντά στην πυρηνική μεμβράνη - η φυλετική χρωματίνη ή το σώμα του Barr, το οποίο σχηματίζεται από ένα, ανενεργό χρωμόσωμα Χ. Το άλλο χρωμόσωμα Χ στα κύτταρα του γυναικείου σώματος είναι ενεργό. Στους άνδρες, υπάρχει μόνο ένα χρωμόσωμα Χ και είναι πάντα ενεργό, επομένως, η φυλετική χρωματίνη δεν προσδιορίζεται στους πυρήνες των κυττάρων του ανδρικού σώματος. Για τη μελέτη της φυλετικής χρωματίνης Χ, συνήθως λαμβάνεται απόξεση από τον στοματικό βλεννογόνο. Η πιο κοινή εξπρές μέθοδος χρώσης σύμφωνα με το Sanders χρησιμοποιώντας διάλυμα οξικού οξέος 2% ακετορσεΐνης ακολουθούμενη από μικροσκοπία εμβάπτισης. Επιπλέον, το λεγόμενο τυμπανικό ανιχνεύεται επίσης σε ώριμα ουδετερόφιλα του αίματος και τα σώματα της χρωματίνης και του τυμπανίου είναι ένα λιγότερο από τον αριθμό των χρωμοσωμάτων Χ. Στα ουδετερόφιλα στους άνδρες ανιχνεύονται επίσης περιπυρηνικοί σχηματισμοί με τη μορφή «νημάτων» και «τριχών». Η εξαφάνιση του ανενεργού χρωμοσώματος Χ στις γυναίκες οδηγεί στην απουσία φυλετικής χρωματίνης. Η εμφάνιση ενός επιπλέον χρωμοσώματος Χ σε έναν άνδρα οδηγεί στο σχηματισμό ενός σώματος φυλετικής χρωματίνης.

Ενδείξεις για κυτταρογενετική εξέταση του ασθενούς:

1) πολλαπλές δυσπλασίες (που περιλαμβάνουν τρία ή περισσότερα συστήματα). οι πιο μόνιμες παραβιάσεις είναι οι δυσπλασίες του εγκεφάλου, του μυοσκελετικού συστήματος, της καρδιάς και του ουρογεννητικού συστήματος.
2) νοητική υστέρηση σε συνδυασμό με διαταραχές σωματικής ανάπτυξης, δυσπλασία, υπογεννητισμό.
3) επίμονη πρωτογενής υπογονιμότητα σε άνδρες και γυναίκες με εξαίρεση τη γυναικολογική και ουρολογική παθολογία.
4) συνήθης αποβολή, ειδικά στα αρχικά στάδια.
5) παραβίαση της σεξουαλικής ανάπτυξης (υπογοναδισμός, σεξουαλικές αναστροφές).
6) μικρό βάρος παιδιού που γεννήθηκε σε πλήρη εγκυμοσύνη.

Η χρήση της κυτταρογενετικής μεθόδου στην κλινική γενετική έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη μιας νέας κατεύθυνσης - κλινικής κυτταρογενετικής, η οποία επιτρέπει:

- να καθορίσει την προέλευση των δομικά αναδιατεταγμένων χρωμοσωμάτων και την ακριβή ταξινόμηση τους.
- να προσδιορίσει τα σύνδρομα που προκαλούνται από μια ανισορροπία στις περιοχές των μεμονωμένων χρωμοσωμάτων.
- να συσσωρεύσει πληροφορίες σχετικά με αλλαγές χρωμοσωμάτων σε κύτταρα όγκου, σε ασθενείς με κληρονομικές ασθένειες του αίματος κ.λπ.

Η βάση της μεθόδου είναι η μικροσκοπική μελέτη του χρωμοσώματος. Οι κυτταρολογικές μελέτες έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως από τις αρχές της δεκαετίας του 1920. εικοστός αιώνας. να μελετήσει τη μορφολογία των χρωμοσωμάτων, καλλιέργεια λευκοκυττάρων για τη λήψη πλακών μετάφασης.

Η ανάπτυξη της σύγχρονης ανθρώπινης κυτταρογενετικής συνδέεται με τα ονόματα των κυτταρολόγων D. Tio και A. Levan. Το 1956, ήταν οι πρώτοι που διαπίστωσαν ότι ένα άτομο έχει 46 χρωμοσώματα, που σηματοδότησε την αρχή μιας ευρείας μελέτης των μιτωτικών και μειοτικών ανθρώπινων χρωμοσωμάτων.

Το 1959, οι Γάλλοι επιστήμονες D. Lejeune, R. Turpin και M. Gauthier καθιέρωσαν τη χρωμοσωμική φύση της νόσου Down. Τα επόμενα χρόνια, πολλά άλλα χρωμοσωμικά σύνδρομα που είναι κοινά στον άνθρωπο έχουν περιγραφεί. Η κυτταρογενετική έχει γίνει ένας σημαντικός κλάδος της πρακτικής ιατρικής. Επί του παρόντος, η κυτταρογενετική μέθοδος χρησιμοποιείται για τη διάγνωση χρωμοσωμικών ασθενειών, τη σύνταξη γενετικών χαρτών χρωμοσωμάτων, τη μελέτη της διαδικασίας μετάλλαξης και άλλα προβλήματα της ανθρώπινης γενετικής.

Το 1960 αναπτύχθηκε στο Ντένβερ η πρώτη διεθνής ταξινόμηση ανθρώπινων χρωμοσωμάτων. Βασίστηκε στο μέγεθος των χρωμοσωμάτων και στη θέση της πρωταρχικής συστολής - του κεντρομερούς. Όλα τα χρωμοσώματα χωρίζονται ως προς το σχήμα σε μεθοκεντρικά, υπομετακεντρικά και ακροκεντρικά και χωρίζονται σε 7 ομάδες, που ορίζονται με λατινικά γράμματα A, B, C, D, E, F, G. Κάθε ζεύγος χρωμοσωμάτων είχε αύξοντα αριθμό από 1 έως 22 , χωρίζονται χωριστά και ονομάζονται λατινικά γράμματα - X και Y φυλετικά χρωμοσώματα.

Το 1971, στο Συνέδριο των Γενετιστών της Πράγας, εκτός από την ταξινόμηση του Ντένβερ, παρουσιάστηκαν μέθοδοι διαφορικού χρωματισμού των χρωμοσωμάτων, χάρη στις οποίες κάθε χρωμόσωμα αποκτά το δικό του μοναδικό μοτίβο, το οποίο βοηθά στην ακριβή αναγνώριση.

Βασικές πληροφορίες σχετικά με τη μορφολογία των ανθρώπινων χρωμοσωμάτων λήφθηκαν με τη μελέτη τους στις μεταφάσεις της μίτωσης και της πρόφασης - τη μετάφαση της μείωσης. Είναι σημαντικό ότι ο αριθμός των διαιρούμενων κυττάρων ήταν υψηλός. Η πιο σημαντική κυτταρογενετική εργασία πραγματοποιήθηκε σε λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος, καθώς η καλλιέργεια λεμφοκυττάρων για 2-3 ημέρες παρουσία φυτοαιμοσυγκολλητίνης καθιστά δυνατή τη λήψη πλακών μεταφάσεως για ανάλυση χρωμοσωμάτων.

Η κυτταρογενετική ανάλυση υποβάλλεται σε πλάκες μετάφασης μονής στιβάδας με ξεχωριστά χρωμοσώματα. Για να γίνει αυτό, τα διαιρούμενα κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με κολχικίνη και ορισμένες χημικές ουσίες.

Ένα σημαντικό βήμα στην κυτταρογενετική ανάλυση είναι η χρώση των παρασκευασμάτων που λαμβάνονται. Πραγματοποιείται με απλές διαφορικές και φθορίζουσες μεθόδους.

Η πρόοδος στην ανθρώπινη μοριακή κυτταρογενετική καθιστά δυνατή την ανάπτυξη νέων μεθόδων για τη μελέτη των χρωμοσωμάτων. Έτσι, θα πρέπει να σημειωθεί η μέθοδος του υβριδισμού φθορισμού, η οποία καθιστά δυνατή τη μελέτη ενός ευρέος φάσματος θεμάτων: από τον εντοπισμό γονιδίων έως την αποκρυπτογράφηση πολύπλοκων αναδιατάξεων μεταξύ πολλών χρωμοσωμάτων.

Έτσι, ο συνδυασμός κυτταρογενετικών και μοριακών γενετικών μεθόδων στην ανθρώπινη γενετική καθιστά τις δυνατότητες διάγνωσης χρωμοσωμικών ανωμαλιών σχεδόν απεριόριστες.

Η κυτταρογενετική είναι ένας κλάδος της γενετικής που μελετά τα πρότυπα κληρονομικότητας και μεταβλητότητας σε επίπεδο κυττάρων και υποκυτταρικών δομών, κυρίως χρωμοσωμάτων. Οι κυτταρογενετικές μέθοδοι έχουν σχεδιαστεί για τη μελέτη της δομής του συνόλου των χρωμοσωμάτων ή των μεμονωμένων χρωμοσωμάτων. Η βάση των κυτταρογενετικών μεθόδων είναι η μικροσκοπική μελέτη των ανθρώπινων χρωμοσωμάτων. Οι μικροσκοπικές μέθοδοι για τη μελέτη των ανθρώπινων χρωμοσωμάτων άρχισαν να χρησιμοποιούνται στα τέλη του 19ου αιώνα. Ο όρος «κυτταρογενετική» εισήχθη το 1903 από τον William Sutton.

Οι κυτταρογενετικές μελέτες έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως από τις αρχές της δεκαετίας του 1920. 20ος αιώνας για τη μελέτη της μορφολογίας των ανθρώπινων χρωμοσωμάτων, την καταμέτρηση των χρωμοσωμάτων, την καλλιέργεια λευκοκυττάρων για τη λήψη πλακών μετάφασης. Το 1959, οι Γάλλοι επιστήμονες D. Lejeune, R. Turpin και M. Gauthier καθιέρωσαν τη χρωμοσωμική φύση της νόσου Down. Τα επόμενα χρόνια, πολλά άλλα χρωμοσωμικά σύνδρομα που είναι κοινά στον άνθρωπο έχουν περιγραφεί. Το 1960, οι R. Moorhead et al. ανέπτυξε μια μέθοδο για την καλλιέργεια λεμφοκυττάρων περιφερικού αίματος για τη λήψη ανθρώπινων μεταφασικών χρωμοσωμάτων, η οποία κατέστησε δυνατή την ανίχνευση χρωμοσωμικών μεταλλάξεων χαρακτηριστικών ορισμένων κληρονομικών ασθενειών.

Η χρήση κυτταρογενετικών μεθόδων: η μελέτη ενός φυσιολογικού ανθρώπινου καρυότυπου, η διάγνωση κληρονομικών ασθενειών που σχετίζονται με γονιδιωματικές και χρωμοσωμικές μεταλλάξεις, η μελέτη της μεταλλαξογόνου δράσης διαφόρων χημικών ουσιών, φυτοφαρμάκων, εντομοκτόνων, φαρμάκων κ.λπ. Το αντικείμενο των κυτταρογενετικών μελετών μπορεί να είναι διαιρούμενα σωματικά, μειοτικά και μεσοφασικά κύτταρα.

ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Μικροσκοπία φωτός Ηλεκτρονική μικροσκοπία Συνεστιακή μικροσκοπία Μικροσκόπιο φθορισμού Μικροσκόπιο φθορισμού

Ενδείξεις για κυτταρογενετικές μελέτες Υποψία χρωμοσωμικής νόσου με βάση κλινικά συμπτώματα (για επιβεβαίωση της διάγνωσης) Η παρουσία πολλαπλών συγγενών δυσπλασιών στο παιδί που δεν σχετίζονται με το γονιδιακό σύνδρομο και τη σωματική ανάπτυξη του παιδιού

Προγεννητική διάγνωση (κατά ηλικία, λόγω παρουσίας μετατόπισης στους γονείς, κατά τη γέννηση προηγούμενου παιδιού με χρωμοσωμική νόσο) Υποψία συνδρόμων που χαρακτηρίζονται από χρωμοσωμική αστάθεια Λευχαιμία (για διαφορική διάγνωση, αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας και της πρόγνωσης θεραπεία) Εκτίμηση μεταλλαξιογόνων επιδράσεων διαφόρων χημικών ουσιών, φυτοφαρμάκων, εντομοκτόνων, φαρμάκων κ.λπ.

Κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης στο στάδιο της μετάφασης, τα χρωμοσώματα έχουν πιο ξεκάθαρη δομή και είναι διαθέσιμα για μελέτη. Συνήθως εξετάζονται τα ανθρώπινα λευκοκύτταρα περιφερικού αίματος, τα οποία τοποθετούνται σε ειδικό θρεπτικό μέσο, όπου διαιρούνται. Στη συνέχεια παρασκευάζονται σκευάσματα και αναλύεται ο αριθμός και η δομή των χρωμοσωμάτων.

Κυτταρογενετικές μελέτες σωματικών κυττάρων Λήψη παρασκευασμάτων μιτωτικών χρωμοσωμάτων Χρώση σκευασμάτων (απλή, διαφορική και φθορίζουσα) Μοριακές κυτταρογενετικές μέθοδοι - μέθοδος έγχρωμης in situ υβριδοποίησης (FISH)

Οι κυτταρογενετικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στην κλινική πράξη περιλαμβάνουν: - κλασσικές μεθόδους καρυότυπου. - μοριακές κυτταρογενετικές μέθοδοι. Μέχρι πρόσφατα, η διάγνωση των χρωμοσωμικών ασθενειών βασιζόταν στη χρήση παραδοσιακών μεθόδων κυτταρογενετικής ανάλυσης.

Για τη μελέτη των χρωμοσωμάτων, χρησιμοποιούνται συχνότερα παρασκευάσματα μιας βραχυπρόθεσμης καλλιέργειας αίματος, καθώς και καλλιέργειες μυελού των οστών και καλλιέργειες ινοβλαστών. Το αίμα με ένα αντιπηκτικό φυγοκεντρείται για την κατακρήμνιση των ερυθροκυττάρων και τα λευκοκύτταρα επωάζονται σε ένα μέσο καλλιέργειας για 2-3 ημέρες. Στο δείγμα αίματος προστίθεται φυτοαιμοσυγκολλητίνη, καθώς επιταχύνει τη συγκόλληση των ερυθρών αιμοσφαιρίων και διεγείρει τη διαίρεση των λεμφοκυττάρων. Η πιο κατάλληλη φάση για τη μελέτη των χρωμοσωμάτων είναι η μετάφαση της μίτωσης, επομένως, η κολχικίνη χρησιμοποιείται για να σταματήσει τη διαίρεση των λεμφοκυττάρων σε αυτό το στάδιο. Η προσθήκη αυτού του φαρμάκου στην καλλιέργεια οδηγεί σε αύξηση της αναλογίας των κυττάρων που βρίσκονται σε μεταφάση, δηλαδή σε εκείνο το στάδιο του κυτταρικού κύκλου όπου τα χρωμοσώματα φαίνονται καλύτερα. Κάθε χρωμόσωμα αναδιπλασιάζεται και, μετά από κατάλληλη χρώση, θεωρείται ως δύο χρωματίδες προσαρτημένες στο κεντρομερές ή κεντρική συστολή. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβάλλονται σε επεξεργασία με ένα υποτονικό διάλυμα χλωριούχου νατρίου, σταθεροποιούνται και χρωματίζονται. Τα χρωμοσώματα συχνά χρωματίζονται με χρώση Romanovsky-Giemsa, 2% ακετκαρμίνη ή 2% ακεταρσεΐνη. Χρωματίζουν ολόκληρα χρωμοσώματα ομοιόμορφα (μέθοδος ρουτίνας) και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση αριθμητικών χρωμοσωμάτων ανωμαλιών.

Denver ταξινόμηση των ανθρώπινων χρωμοσωμάτων (1960). Ομάδα Α (1-3) - τρία ζεύγη από τα μεγαλύτερα χρωμοσώματα: δύο μετακεντρικά και 1 υπομετακεντρικό. Ομάδα Β - (4-5) - δύο ζεύγη μακρών υπομετακεντρικών χρωμοσωμάτων. Ομάδα Γ (6-12) - 7 ζεύγη μεσαίου μεγέθους υπομετακεντρικών αυτοσωμάτων και ένα χρωμόσωμα Χ. Ομάδα Δ (13-15) - τρία ζεύγη μεσαίων ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων. Ομάδα Ε (16 -18) - τρία ζεύγη μετακεντρικών και υπομετακεντρικών χρωμοσωμάτων. Ομάδα F (19-20) - δύο ζεύγη μικρών μετακεντρικών χρωμοσωμάτων. Ομάδα G (21-22 και Υ) - δύο ζεύγη μικρών ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων και ένα χρωμόσωμα Υ.

1. Συνήθης (ομοιόμορφη) χρώση 2. Χρησιμοποιείται για την ανάλυση του αριθμού των χρωμοσωμάτων και τον εντοπισμό δομικών διαταραχών (εκτροπές). Με τη συνήθη χρώση, μόνο μια ομάδα χρωμοσωμάτων μπορεί να αναγνωριστεί αξιόπιστα, με διαφορική χρώση, όλα τα χρωμοσώματα

Ιδιόγραμμα ανθρώπινων χρωμοσωμάτων σύμφωνα με τις ταξινομήσεις Denver και Paris A B C E D F G

Μέθοδοι διαφορικής χρώσης χρωμοσωμάτων Χρώση Q - Χρώση Kaspersson με acrichiniprite με εξέταση σε μικροσκόπιο φθορισμού. Συχνά χρησιμοποιείται για τη μελέτη των χρωμοσωμάτων Υ. G-χρώση - τροποποιημένη χρώση κατά Romanovsky - Giemsa. Η ευαισθησία είναι υψηλότερη από αυτή της χρώσης Q και επομένως χρησιμοποιείται ως τυπική μέθοδος για κυτταρογενετική ανάλυση. Χρησιμοποιείται για την ανίχνευση μικρών εκτροπών και χρωμοσωμάτων δεικτών (τμηματοποιημένα διαφορετικά από τα κανονικά ομόλογα χρωμοσώματα) Χρησιμοποιείται χρώση R - πορτοκαλί ακριδίνης και παρόμοιες βαφές, ενώ χρωματίζονται τμήματα χρωμοσωμάτων που δεν είναι ευαίσθητα στη χρώση G. C-χρώση - χρησιμοποιείται για την ανάλυση των κεντρομερών περιοχών των χρωμοσωμάτων που περιέχουν συστατική ετεροχρωματίνη. Τ-χρώση - χρησιμοποιείται για την ανάλυση των τελομερών περιοχών των χρωμοσωμάτων.

Οι περιοχές ισχυρής και ασθενής συμπύκνωσης κατά το μήκος του χρωμοσώματος είναι συγκεκριμένες για κάθε χρωμόσωμα και έχουν διαφορετικές εντάσεις χρώματος.

Ο υβριδισμός φθορισμού in situ (FISH) είναι ένας φασματικός καρυότυπος που συνίσταται στη χρώση χρωμοσωμάτων με ένα σύνολο φθορίζουσες χρωστικές που συνδέονται σε συγκεκριμένες περιοχές χρωμοσωμάτων. Ως αποτέλεσμα μιας τέτοιας χρώσης, ομόλογα ζεύγη χρωμοσωμάτων αποκτούν πανομοιότυπα φασματικά χαρακτηριστικά, γεγονός που διευκολύνει σε μεγάλο βαθμό την αναγνώριση τέτοιων ζευγών και την ανίχνευση διαχρωμοσωμικών μετατοπίσεων, δηλαδή οι κινήσεις τμημάτων μεταξύ χρωμοσωμάτων - μετατοπισμένες τομές έχουν φάσμα που διαφέρει από το φάσμα του υπόλοιπου χρωμοσώματος.

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Fluorescence in situ hybridization, ή μέθοδος FISH, είναι μια κυτταρογενετική μέθοδος που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση και τον προσδιορισμό της θέσης μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA σε χρωμοσώματα μεταφάσης ή σε πυρήνες μεσοφάσεως in situ. Ο υβριδισμός φθορισμού in situ χρησιμοποιεί ανιχνευτές DNA (ανιχνευτές DNA) που συνδέονται με συμπληρωματικούς στόχους στο δείγμα. Οι ανιχνευτές DNA περιέχουν νουκλεοσίτες επισημασμένους με φθοροφόρα (άμεση επισήμανση) ή συζυγή όπως βιοτίνη ή διγοξιγενίνη (έμμεση επισήμανση).

Προσδιορισμός μετατόπισης t (9; 22) (q 34; q 11) στη χρόνια μυελογενή λευχαιμία χρησιμοποιώντας τη μέθοδο FISH, το γονίδιο ABL 1 (χρωμόσωμα 9) συνδυάζεται με το γονίδιο BCR (χρωμόσωμα 22) - ένα χιμαιρικό γονίδιο BCR-ABL 1 σχηματίζεται.Πλάκα μετάφασης με το χρωμόσωμα Philadelphia. Τα χρωμοσώματα χρωματίζονται μπλε, ο τόπος ABL 1 είναι κόκκινος και ο τόπος BCR είναι πράσινος. Επάνω αριστερά - ένα αναδιατεταγμένο χρωμόσωμα, σημειωμένο με μια κόκκινη-πράσινη κουκκίδα.

Το Multicolor FISH είναι ένας φασματικός καρυότυπος που συνίσταται στη χρώση χρωμοσωμάτων με ένα σύνολο φθορίζουσες χρωστικές που συνδέονται σε συγκεκριμένες περιοχές των χρωμοσωμάτων. Ως αποτέλεσμα μιας τέτοιας χρώσης, ομόλογα ζεύγη χρωμοσωμάτων αποκτούν πανομοιότυπα φασματικά χαρακτηριστικά, γεγονός που διευκολύνει σε μεγάλο βαθμό την αναγνώριση τέτοιων ζευγών και την ανίχνευση διαχρωμοσωμικών μετατοπίσεων, δηλαδή οι κινήσεις τμημάτων μεταξύ χρωμοσωμάτων - μετατοπισμένες τομές έχουν φάσμα που διαφέρει από το φάσμα του υπόλοιπου χρωμοσώματος.

Καρυότυπος 46, XY, t(1; 3)(p 21; q 21), del(9)(q 22) Μετατόπιση μεταξύ του 1ου και του 3ου χρωμοσώματος, διαγραφή του 9ου χρωμοσώματος. Η σήμανση των περιοχών των χρωμοσωμάτων δίνεται τόσο από σύμπλοκα εγκάρσιων σημαδιών (κλασικός καρυότυπος, λωρίδες) όσο και από το φάσμα φθορισμού (χρώμα, φασματικός καρυότυπος).