namai › Variklis › Citogenetinio metodo tyrimai. Genetiniai metodai

Citogenetinio metodo tyrimai. Genetiniai metodai

Citogenetiniai (kariotipiniai, kariotipiniai) metodai pirmiausia naudojami tiriant atskirų individų kariotipus.

Šio metodo esmė yra ištirti atskirų chromosomų struktūrą, taip pat žmogaus ląstelių chromosomų rinkinio ypatybes normaliomis ir patologinėmis sąlygomis. Limfocitai, žando epitelio ląstelės ir kitos ląstelės, kurias lengva gauti, kultivuoti ir atlikti kariologinę analizę, tam yra patogus objektas. Tai svarbus žmogaus lyties ir chromosomų paveldimų ligų nustatymo metodas.

Citogenetinio metodo pagrindas yra atskirų žmogaus ląstelių chromosomų morfologijos tyrimas. Šiuolaikiniam chromosomų sandaros suvokimo etapui būdingas šių svarbiausių branduolio struktūrų molekulinių modelių kūrimas, atskirų chromosomų komponentų vaidmens saugant ir perduodant paveldimą informaciją tyrimas.

Kariotipo pokyčiai dažniausiai siejami su genetinių ligų išsivystymu. Žmogaus ląstelių auginimo dėka galima greitai gauti pakankamai didelės medžiagos preparatams ruošti. Kariotipams nustatyti dažniausiai naudojama trumpalaikė periferinio kraujo leukocitų kultūra.

Citogenetiniai metodai taip pat naudojami interfazinėms ląstelėms apibūdinti. Pavyzdžiui, pagal lyties chromatino (Barro kūnų, kurie yra inaktyvuotos X chromosomos) buvimą ar nebuvimą galima ne tik nustatyti asmenų lytį, bet ir nustatyti kai kurias genetines ligas, susijusias su X skaičiaus pasikeitimu. chromosomos.

Metodas leidžia nustatyti kariotipą (struktūrines ypatybes ir chromosomų skaičių), įrašant kariogramą. Citogenetinis tyrimas atliekamas probandui, jo tėvams, giminaičiams ar vaisiui, jei įtariamas chromosominis sindromas ar kitas chromosomų sutrikimas.

Kariotipų nustatymas- citogenetinis metodas - leidžiantis nustatyti chromosomų struktūros ir skaičiaus nukrypimus, galinčius sukelti nevaisingumą, kitas paveldimas ligas ir sergančio vaiko gimimą.

Medicininėje genetikoje svarbūs du pagrindiniai kariotipų nustatymo tipai:

tiriant pacientų kariotipą
prenatalinis kariotipavimas – vaisiaus chromosomų tyrimas

Citogenetinis metodas tiriant žmogaus genetiką. X ir Y chromatino nustatymas. Chromosomų ligų, susijusių su kariotipo lytinių chromosomų skaičiaus anomalijomis, diagnozavimo metodo vertė.

X ir Y chromatino nustatymas dažnai vadinamas greitos sekso diagnostikos metodu. Ištirti burnos ertmės gleivinės ląsteles, makšties epitelį ar plaukų folikulus. Moteriškų ląstelių branduoliuose diploidiniame rinkinyje yra dvi X chromosomos, iš kurių viena yra visiškai inaktyvuota (spiralizuota, tankiai supakuota) jau ankstyvose embriono vystymosi stadijose ir matoma kaip heterochromatino gumulas, prisitvirtinęs prie branduolio membranos. . Inaktyvuota X chromosoma vadinama lytiniu chromatinu arba Barro kūnu. Norint aptikti lytinį X-chromatiną (Barr kūnus) ląstelių branduoliuose, tepinėliai dažomi acetarceinu ir preparatai apžiūrimi naudojant įprastą šviesos mikroskopą. Paprastai moterys turi vieną X-chromatino gumulėlį, o vyrai neturi.

Norint nustatyti vyriškos lyties Y-lyties chromatiną (F-kūną), tepinėliai nudažomi chinacrinu ir apžiūrimi fluorescenciniu mikroskopu. Y-chromatinas atsiskleidžia stipriai šviečiančio taško pavidalu, kurio dydis ir liuminescencijos intensyvumas skiriasi nuo kitų chromocentrų. Jis randamas vyrų kūno ląstelių branduoliuose.

Barr kūno nebuvimas moterims rodo chromosomų ligą - Shereshevsky-Turner sindromą (45 kariotipas, X0). Barr kūno buvimas vyrams rodo Klinefelterio sindromą (47 kariotipas, XXY).

X ir Y chromatino nustatymas yra atrankos metodas, galutinė chromosomų ligos diagnozė nustatoma tik ištyrus kariotipą.

Citogenetinis metodas

Citogenetinis metodas naudojamas normaliam žmogaus kariotipui tirti, taip pat diagnozuojant paveldimas ligas, susijusias su genominėmis ir chromosomų mutacijomis.
Be to, šis metodas naudojamas tiriant įvairių cheminių medžiagų, pesticidų, insekticidų, vaistų ir kt. mutageninį poveikį.
Ląstelių dalijimosi metafazės stadijoje metu chromosomos turi aiškesnę struktūrą ir yra prieinamos tyrimams. Žmogaus diploidų rinkinį sudaro 46 chromosomos:
22 poros autosomų ir viena pora lytinių chromosomų (XX moterims, XY vyrams). Dažniausiai tiriami žmogaus periferinio kraujo leukocitai, kurie dedami į specialią maistinę terpę, kur dalijasi. Tada ruošiami preparatai, analizuojamas chromosomų skaičius ir struktūra. Specialių dažymo metodų sukūrimas labai supaprastino visų žmogaus chromosomų atpažinimą, o kartu su genealoginiu metodu ir ląstelių bei genų inžinerijos metodais leido susieti genus su specifiniais chromosomų regionais. Sudėtingas šių metodų taikymas yra žmogaus chromosomų kartografavimo pagrindas.

Citologinė kontrolė būtina diagnozuojant chromosomų ligas, susijusias su ansuploidija ir chromosomų mutacijomis. Dažniausios yra Dauno liga (trisomija 21-oje chromosomoje), Klinefelterio sindromas (47 XXY), Šerševskio-Turnerio sindromas (45 XO) ir kt. Netekus vienos iš homologinių 21-osios poros chromosomų dalies, atsiranda kraujas. liga – lėtinė mieloidinė leukemija.

Citologiniai somatinių ląstelių tarpfazių branduolių tyrimai gali atskleisti vadinamąjį Baro kūną arba lytinį chromatiną. Paaiškėjo, kad lytinio chromatino paprastai yra moterims, o vyrams jo nėra. Tai yra vienos iš dviejų moterų X chromosomų heterochromatizacijos rezultatas. Žinant šią savybę, galima nustatyti lytį ir nustatyti nenormalų X chromosomų skaičių.

Daugelį paveldimų ligų galima nustatyti dar iki vaiko gimimo. Prenatalinės diagnostikos metodas susideda iš amniono skysčio gavimo, kuriame yra vaisiaus ląstelės, ir tolesnio biocheminio bei citologinio galimų paveldimų anomalijų nustatymo. Tai leidžia nustatyti diagnozę ankstyvose nėštumo stadijose ir nuspręsti, ar ją tęsti, ar nutraukti.

Citogenetika yra nepriklausoma paveldimumo tyrimo šaka, tirianti įvairius, pirmiausia stebimus (išaiškintus) nešiklius, kuriuose yra informacijos apie genetinį paveldimumą. Tokie nešiotojai yra įvairių tipų chromosomos (politeninės, mitozinės ir mejotinės), plastidės, tarpfaziniai branduoliai ir, kiek mažesniu mastu, mitochondrijos.

Remiantis tuo, citogenetinis metodas – tai visų pirma chromosomų tyrimo metodų ir technologijų rinkinys, kurio metu nustatomas jų kiekybinis parametras, atliekamas cheminis ir biologinis aprašymas, tiriama ląstelių dalijimosi struktūra ir elgsenos būdai. . Šio tyrimo mokslinis uždavinys – nustatyti ryšį tarp chromosomų struktūros pokyčių prigimties ir dinamikos bei paveikslo, atspindinčio simbolių kintamumą.

Viena iš svarbiausių tyrimų sričių, kuri apima citogenetinį metodą, yra žmogaus kariotipo analizė. Šis tyrimas, kaip taisyklė, atliekamas su kultūromis, kuriose vyksta gemalo ir somatinių ląstelių dalijimasis.

Labiausiai paplitusi kultūra tokio pobūdžio tyrimams yra periferinės kraujo ląstelės, tokios kaip limfocitai, fibroblastai ir kaulų čiulpų ląstelės. Labiausiai prieinama kultūra, naudojama medicininėje citogenetikoje, yra kraujo limfocitai. Taip yra todėl, kad paprastai jie yra analizuojami, o vaisiaus atveju citogenetinis metodas apima ląstelių kultūrų naudojimą, kurių pasirinkimą lemia daugybė veiksnių. Pagrindinis yra nėštumo laikotarpis. Pavyzdžiui, šiuo trumpesniu nei 12 savaičių laikotarpiu citogenetinę chromosomų analizę geriausia atlikti dalyvaujant choriono ląstelėms, o esant ilgesniam nei 12 savaičių nėštumo laikotarpiui, tyrimams patartina atsižvelgti į paties vaisiaus ląsteles. Šiuo tikslu jie yra specialiai izoliuojami nuo placentos ir vaisiaus kraujo.

Norint nustatyti kariotipą, citogenetiniam paveldimumui reikia paimti bent 1–2 ml kraujo mėginį. Tuo pačiu metu pats metodas apima tyrimą, kurį sudaro trys pagrindiniai etapai:

Išskyrimas ir kurio pagrindu bus atliekama analizė;

Vaisto spalva;

Atlikti išsamią vaisto analizę mikroskopu.

Citogenetinis genetikos metodas gali būti veiksmingas tik tada, kai tenkinamos šios sąlygos. Pirma, metafazės stadijoje turi būti tam tikras ląstelių skaičius. Antra, auginimas turi būti atliekamas griežtai laikantis nustatytų taisyklių ir ne trumpiau kaip 72 valandas. Trečia, ląstelės turėtų būti fiksuojamos tirpalu ir metanoliu griežtu šių medžiagų santykiu 3:1.

Dažymo etape ruošiamasi spalvų pasirinkimui, atsižvelgiant į patį tyrimo tikslą, tai yra, kokio tipo pertvarkymus reikia ištirti. Dažniausiai naudojamas nuolatinio dažymo metodas, nes jis yra pats paprasčiausias kiekybiniam chromosomų parametrui nustatyti. Šiuolaikiniai tyrimai dažniausiai naudoja šį dažymo metodą, kad nustatytų kariotipo anomalijas jų kiekybinėje išraiškoje. Tačiau toks citogenetinis metodas neleidžia nustatyti ir atskleisti chromosomų struktūrinės dinamikos. Todėl naudojami kiti, specialūs metodai, leidžiantys išlyginti šį nuolatinio dažymo metodo trūkumą. Dažniausi iš jų, pavyzdžiui, diferencijuoto spalvinimo metodas, G-metodas, R-metodas ir kt.

Ir, galiausiai, trečiasis tyrimo etapas susideda iš nudažytų chromosomų, kurios yra metafazės stadijoje, mikroskopinis tyrimas. Jo metu nustatomas normalių ir nenormalių žmogaus vaisiaus kūno ląstelių skaičius. Tam, kaip taisyklė, atliekama kelių audinių analizė.

Kariotipui nustatyti naudojami tiek tiesioginiai, tiek netiesioginiai tyrimo metodai. Pirmuoju atveju medžiaga, paimta iš kaulų čiulpų, limfmazgių, embriono audinių, choriono, vaisiaus vandenų ląstelių ar kitų audinių, tiriama iš karto po gavimo. Tačiau tiesioginis metodas yra informatyvus tik tada, kai medžiagoje yra pakankamai mitozinių metafazių, nes tik šioje fazėje chromosomos įgyja jiems būdingus struktūrinius požymius ir galimas tikslus jų identifikavimas. Šiuo metu plačiai naudojami netiesioginiai tyrimo metodai.

Metafazių plokščių paruošimo būdas. Paimta kultūra (periferinio kraujo limfocitai ir kt.) dedama į maistinę terpę auginimui. Paprastai periferiniame kraujyje limfocitų mitozė nepastebima, todėl naudojami vaistai (fitohemagliutininas), kurie skatina imunologinę limfocitų transformaciją ir jų dalijimąsi. Antrasis žingsnis yra sustabdyti mitozinį ląstelių dalijimąsi metafazės stadijoje. Tai pasiekiama likus 2-3 valandoms iki auginimo pabaigos į audinių kultūrą įdedant kolchicino arba kolcimedo. Trečiajame etape, naudojant hipotoninį kalcio chlorido arba natrio citrato tirpalą, pasiekiama ląstelių hipotonizacija, dėl kurios ląstelė išsipučia, branduolio membrana nutrūksta, tarpchromosominiai ryšiai nutrūksta, o chromosomos laisvai plūduriuoja citoplazmoje. . Tada gauta kultūra fiksuojama metanolio ir acto rūgšties mišiniu, centrifuguojama ir fiksatorius pakeičiamas. Suspensija su fiksatoriumi užtepama ant švaraus stiklelio, kuriame plečiasi metafazės plokštelė ir joje yra atskiros chromosomos. Kai fiksatorius džiūsta, narvas tvirtai pritvirtinamas prie stiklo. Taigi, nepaisant ląstelių kultūros, iš kurios buvo gautos metafazės plokštelės, bendras preparatų gavimo principas yra toks: metafazių kaupimas, hipotonizavimas, fiksavimas, įkasimas ant stiklelio.

Vaisto spalva. Dažymo preparatai yra kitas etapas gavus metafazines plokšteles ir skirstomas į paprastus, diferencijuotus ir fluorescencinius. Kiekvienas dažymo tipas naudojamas aptikti tik tam tikrus kariotipo pokyčius. Taikant paprastą dažymą (Giemsa dažymo metodas), galimas tik grupinis chromosomų identifikavimas, todėl šis metodas naudojamas apytiksliai skaitinių kariotipo anomalijų nustatymui. Paprastas dažymas plačiai naudojamas tiriant chromosomų mutagenezę, kai tiriami aplinkos veiksniai mutacijai nustatyti. Giemsa dėmė tolygiai nudažo visas chromosomas per visą ilgį, tuo pačiu kontūruodama centromerą, palydovus ir antrinius susiaurėjimus. Diferencinis dažymas atsiranda dėl galimybės selektyviai dažyti išilgai ir yra užtikrinamas dėl gana paprasto temperatūros ir druskos poveikio fiksuotoms chromosomoms. Tokiu atveju atskleidžiama struktūrinė chromosomų diferenciacija išilgai, kuri išreiškiama kaip eu- ir heterochromatinių sričių (tamsiųjų ir šviesių), kurios būdingos kiekvienai chromosomai, atitinkamai rankai ir sričiai, kaita. Dažniausiai naudojamas G beicas. Šiuo atveju chromosomos iš anksto apdorojamos proteazės arba druskos tirpalu. Žmonių mutacijos procesui tirti plačiai naudojamas seserinių chromatidų diferencinio dažymo metodas, pagrįstas galimybe būti įtrauktam į timidino analogo-5-bromodeoksiuridino chromosomos replikacijos seką. Chromosomų sritys, kuriose yra šis analogas, blogai nusidažo, todėl naudojant šį metodą galima nustatyti bet kokį chromosomų ar chromosomų persitvarkymą.

Lyties chromatino tyrimas. Lyties chromatino nustatymo metodas yra greitesnis ir paprastesnis nei chromosomų rinkinio (kariotipo) tyrimas, todėl jis naudojamas kaip vienas iš atrankos testų atliekant masines gyventojų apklausas. Įprastai moters kūno ląstelėse tam tikrais dažymo būdais prie branduolinės membranos susidaro intensyviai nudažytas kūnas – lyties chromatinas, arba Barro kūnas, kurį sudaro viena, neaktyvi X chromosoma. Kita X chromosoma moters kūno ląstelėse yra aktyvi. Vyrams yra tik viena X chromosoma ir ji visada yra aktyvi, todėl vyriškojo kūno ląstelių branduoliuose lytinis chromatinas nenustatytas. Lytinio chromatino X tyrimui dažniausiai imamas burnos gleivinės įbrėžimas. Labiausiai paplitęs greitas dažymo būdas pagal Sandersą, naudojant 2% acto rūgšties acetoorceino tirpalą, o po to imersinę mikroskopiją. Be to, vadinamieji tympani taip pat aptinkami brandžiuose kraujo neutrofiluose, o chromatino ir tympani kūnai yra vienu mažiau nei X chromosomų. Vyrų neutrofiluose taip pat aptinkami perinukleariniai dariniai „siūlų“ ir „plaukelių“ pavidalu. Neaktyvios X chromosomos išnykimas moterims lemia lytinio chromatino nebuvimą. Vyrui atsiradus papildomai X chromosomai, susidaro lytinio chromatino kūnas.

Indikacijos paciento citogenetiniam tyrimui:

1) daugybiniai apsigimimai (apima tris ar daugiau sistemų); nuolatiniai pažeidimai yra smegenų, raumenų ir kaulų sistemos, širdies ir urogenitalinės sistemos apsigimimai;
2) protinis atsilikimas kartu su fizinio vystymosi sutrikimais, displazija, hipogenitalizmu;
3) nuolatinis pirminis vyrų ir moterų nevaisingumas, išskyrus ginekologinę ir urologinę patologiją;
4) įprastas persileidimas, ypač ankstyvosiose stadijose;
5) lytinės raidos pažeidimas (hipogonadizmas, seksualinės inversijos);
6) mažas vaiko, gimusio pilnalaikio nėštumo metu, svoris.

Citogenetinio metodo panaudojimas klinikinėje genetikoje paskatino sukurti naują kryptį – klinikinę citogenetiką, kuri leidžia:

- nustatyti struktūriškai persitvarkytų chromosomų kilmę ir tikslią jų klasifikaciją;
- nustatyti sindromus, kuriuos sukelia atskirų chromosomų regionų disbalansas;
- kaupti informaciją apie chromosomų pokyčius navikinėse ląstelėse, sergant paveldimomis kraujo ligomis ir kt.

Metodo pagrindas – mikroskopinis chromosomos tyrimas. Citologiniai tyrimai buvo plačiai naudojami nuo XX amžiaus 20-ųjų pradžios. dvidešimtas amžius. tirti chromosomų morfologiją, leukocitų auginimas metafazėms plokštelėms gauti.

Šiuolaikinės žmogaus citogenetikos raida siejama su citologų D. Tio ir A. Levano vardais. 1956 metais jie pirmieji nustatė, kad žmogus turi 46 chromosomas, kuris pažymėjo plataus žmogaus mitozinių ir mejotinių chromosomų tyrimo pradžią.

1959 metais prancūzų mokslininkai D. Lejeune'as, R. Turpinas ir M. Gauthier nustatė Dauno ligos chromosominį pobūdį. Vėlesniais metais buvo aprašyta daug kitų chromosomų sindromų, kurie būdingi žmonėms. Citogenetika tapo svarbia praktinės medicinos šaka. Šiuo metu citogenetinis metodas taikomas chromosomų ligų diagnostikai, chromosomų genetinių žemėlapių sudarymui, mutacijų proceso ir kitoms žmogaus genetikos problemoms tirti.

1960 m. Denveryje buvo sukurta pirmoji tarptautinė žmogaus chromosomų klasifikacija. Jis buvo pagrįstas chromosomų dydžiu ir pirminio susiaurėjimo – centromero – padėtimi. Visos chromosomos pagal formą skirstomos į metocentrines, submetacentrines ir akrocentrines ir suskirstytos į 7 grupes, žymimas lotyniškomis raidėmis A, B, C, D, E, F, G. Kiekviena chromosomų pora buvo suteikta serijos numeriu nuo 1 iki 22 , atskirti atskirai ir pavadinti lotyniškomis raidėmis – X ir Y lytinėmis chromosomomis.

1971 m. Prahos genetikų konferencijoje, be Denverio klasifikacijos, buvo pristatyti diferencinio chromosomų dažymo metodai, kurių dėka kiekviena chromosoma įgauna savo unikalų modelį, kuris padeda tiksliai identifikuoti.

Pagrindinė informacija apie žmogaus chromosomų morfologiją buvo gauta tiriant jas mitozės ir profazės metafazėse – mejozės metafazėje. Svarbu, kad besidalijančių ląstelių skaičius būtų didelis. Svarbiausias citogenetinis darbas buvo atliktas su periferinio kraujo limfocitais, nes limfocitų auginimas 2-3 dienas esant fitohemagliutininui leidžia gauti metafazines plokšteles chromosomų analizei.

Citogenetinei analizei atliekamos vieno sluoksnio metafazės plokštelės su atskiromis chromosomomis. Norėdami tai padaryti, besidalijančios ląstelės apdorojamos kolchicinu ir kai kuriomis cheminėmis medžiagomis.

Svarbus citogenetinės analizės etapas yra gautų preparatų dažymas. Tai atliekama paprastais diferencialiniais ir fluorescenciniais metodais.

Žmogaus molekulinės citogenetikos pažanga leidžia sukurti naujus chromosomų tyrimo metodus. Taigi reikėtų atkreipti dėmesį į fluorescencinės hibridizacijos metodą, leidžiantį tirti daugybę klausimų: nuo genų lokalizacijos iki sudėtingų kelių chromosomų pertvarkymų iššifravimo.

Taigi citogenetinių ir molekulinių genetinių metodų derinimas žmogaus genetikoje leidžia diagnozuoti chromosomų anomalijas beveik neribotas.

Citogenetika yra genetikos šaka, tirianti paveldimumo ir kintamumo modelius ląstelių ir tarpląstelinių struktūrų, daugiausia chromosomų, lygiu. Citogenetiniai metodai skirti tirti chromosomų rinkinio ar atskirų chromosomų struktūrą. Citogenetinių metodų pagrindas yra žmogaus chromosomų mikroskopinis tyrimas. Mikroskopiniai žmogaus chromosomų tyrimo metodai pradėti taikyti XIX amžiaus pabaigoje. Terminą „citogenetika“ 1903 metais įvedė Williamas Suttonas.

Citogenetiniai tyrimai buvo plačiai naudojami nuo 1920-ųjų pradžios. 20 amžiaus už žmogaus chromosomų morfologijos tyrimą, chromosomų skaičiavimą, leukocitų kultivavimą metafazėms plokštelėms gauti. 1959 metais prancūzų mokslininkai D. Lejeune'as, R. Turpinas ir M. Gauthier nustatė Dauno ligos chromosominį pobūdį. Vėlesniais metais buvo aprašyta daug kitų chromosomų sindromų, kurie būdingi žmonėms. 1960 metais R. Moorhead ir kt. sukūrė periferinio kraujo limfocitų kultivavimo metodą žmogaus metafazėms chromosomoms gauti, kuris leido aptikti tam tikroms paveldimoms ligoms būdingas chromosomų mutacijas.

Citogenetinių metodų naudojimas: normalaus žmogaus kariotipo tyrimas, paveldimų ligų, susijusių su genomo ir chromosomų mutacijomis, diagnostika, įvairių cheminių medžiagų, pesticidų, insekticidų, vaistų ir kt. mutageninio poveikio tyrimas. Citogenetinių tyrimų objektas gali dalijasi somatinėmis, mejozinėmis ir tarpfazinėmis ląstelėmis.

CITOGENETINIAI METODAI Šviesos mikroskopija Elektronų mikroskopija Konfokalinė mikroskopija Fluorescencinė mikroskopija Fluorescencinė mikroskopija

Indikacijos citogenetiniams tyrimams Įtarimas dėl chromosomų ligos, pagrįstas klinikiniais simptomais (diagnozei patvirtinti) Dauginių įgimtų vaiko apsigimimų, nesusijusių su genų sindromu ir fizine vaiko raida, buvimas.

Prenatalinė diagnozė (pagal amžių, dėl tėvų translokacijos buvimo, gimus ankstesniam vaikui, sergančiam chromosomų liga) Įtarimas dėl sindromų, kuriems būdingas chromosomų nestabilumas Leukemija (diferencinei diagnostikai, gydymo efektyvumo įvertinimui ir ligos prognozei. gydymas) Įvairių cheminių medžiagų, pesticidų, insekticidų, vaistų ir kt. mutageninio poveikio įvertinimas.

Ląstelių dalijimosi metafazės stadijoje metu chromosomos turi aiškesnę struktūrą ir yra prieinamos tyrimams. Dažniausiai tiriami žmogaus periferinio kraujo leukocitai, kurie dedami į specialią maistinę terpę, kur dalijasi. Tada ruošiami preparatai, analizuojamas chromosomų skaičius ir struktūra.

Somatinių ląstelių citogenetiniai tyrimai Mitozinių chromosomų preparatų gavimas Preparatų dažymas (paprastas, diferencinis ir fluorescencinis) Molekuliniai citogenetiniai metodai – spalvų in situ hibridizacijos metodas (FISH)

Klinikinėje praktikoje naudojami citogenetiniai metodai: - klasikiniai kariotipų nustatymo metodai; - molekuliniai citogenetiniai metodai. Dar visai neseniai chromosomų ligų diagnostika buvo pagrįsta tradicinių citogenetinės analizės metodų taikymu.

Chromosomų tyrimams dažniausiai naudojami trumpalaikės kraujo kultūros preparatai, taip pat kaulų čiulpų ląstelės ir fibroblastų kultūros. Kraujas su antikoaguliantu centrifuguojamas, kad nusodintų eritrocitus, o leukocitai inkubuojami auginimo terpėje 2-3 dienas. Į kraujo mėginį dedama fitohemagliutinino, kuris pagreitina raudonųjų kraujo kūnelių agliutinaciją ir skatina limfocitų dalijimąsi. Tinkamiausia chromosomų tyrimo fazė yra mitozės metafazė, todėl šiame etape limfocitų dalijimuisi stabdyti naudojamas kolchicinas. Pridėjus šio vaisto į kultūrą, padidėja ląstelių, kurios yra metafazėje, ty toje ląstelių ciklo stadijoje, kai geriausiai matomos chromosomos, dalis. Kiekviena chromosoma replikuojasi ir po atitinkamo dažymo matoma kaip dvi chromatidės, pritvirtintos prie centromero arba centrinio susiaurėjimo. Tada ląstelės apdorojamos hipotoniniu natrio chlorido tirpalu, fiksuojamos ir nudažomos. Chromosomos dažnai dažomos Romanovskio-Giemsa dažais, 2% acetkarminu arba 2% acetarseinu. Jie vienodai nudažo visas chromosomas (įprastas metodas) ir gali būti naudojami skaitmeninėms chromosomų anomalijoms aptikti.

Denverio žmogaus chromosomų klasifikacija (1960). A grupė (1-3) – trys didžiausių chromosomų poros: dvi metacentrinės ir 1 submetacentrinė. B grupė – (4-5) – dvi poros ilgų submetacentrinių chromosomų. C grupė (6 -12) – 7 poros vidutinio dydžio submetacentrinių autosomų ir X chromosoma. D grupė (13-15) – trys poros vidutinių akrocentrinių chromosomų. E grupė (16 -18) – trys poros metacentrinių ir submetacentrinių chromosomų. F grupė (19-20) – dvi poros mažų metacentrinių chromosomų. G grupė (21-22 ir Y) – dvi poros mažų akrocentrinių chromosomų ir Y chromosoma.

1. Įprastas (vienodas) dažymas 2. Naudojamas chromosomų skaičiui analizuoti ir struktūriniams sutrikimams (aberacijoms) nustatyti. Įprastu dažymu galima patikimai identifikuoti tik chromosomų grupę, o diferencijuotai dažant visas chromosomas

Žmogaus chromosomų idiograma pagal Denverio ir Paryžiaus klasifikacijas A B C E D F G

Diferencinio chromosomų dažymo metodai Q dažymas - Kasperssono dažymas akricinipritu, tiriant fluorescenciniu mikroskopu. Dažniausiai naudojamas Y chromosomoms tirti. G-dažymas – modifikuotas dažymas pagal Romanovsky – Giemsa. Jautrumas yra didesnis nei Q dažymo, todėl naudojamas kaip standartinis citogenetinės analizės metodas. Naudojamas aptikti mažas aberacijas ir žymenų chromosomas (segmentuotas kitaip nei normalios homologinės chromosomos) R dažymas – naudojami akridino oranžiniai ir panašūs dažai, o dažant G dažymui nejautrias chromosomų dalis. C dažymas – naudojamas chromosomų, kuriose yra konstitucinio heterochromatino, centromerinėms sritims analizuoti. T dažymas – naudojamas chromosomų telomerinėms sritims analizuoti.

Stiprios ir silpnos kondensacijos sritys išilgai chromosomos ilgio yra būdingos kiekvienai chromosomai ir turi skirtingą spalvų intensyvumą.

Fluorescencinė in situ hibridizacija (FISH) yra spektrinis kariotipų nustatymas, kurį sudaro chromosomų dažymas fluorescencinių dažų rinkiniu, kuris jungiasi prie konkrečių chromosomų sričių. Dėl tokio dažymo homologinės chromosomų poros įgauna identiškas spektrines charakteristikas, o tai labai palengvina tokių porų identifikavimą ir tarpchromosominių translokacijų aptikimą, tai yra pjūvių judėjimą tarp chromosomų - perkeltos sekcijos turi spektrą, kuris skiriasi nuo spektro. likusios chromosomos dalies.

Fluorescencinė in situ hibridizacija (FISH) Fluorescencinė in situ hibridizacija arba FISH metodas yra citogenetinis metodas, naudojamas aptikti ir nustatyti konkrečios DNR sekos padėtį metafazės chromosomose arba tarpfaziniuose branduoliuose in situ. Fluorescencinei hibridizacijai in situ naudojami DNR zondai (DNR zondai), kurie jungiasi prie papildomų taikinių mėginyje. DNR zonduose yra nukleozidų, paženklintų fluoroforais (tiesioginis žymėjimas) arba konjugatų, tokių kaip biotinas ar digoksigeninas (netiesioginis žymėjimas).

Translokacijos t (9; 22) (q 34; q 11) nustatymas sergant lėtine mieloleukemija FISH metodu, ABL 1 genas (9 chromosoma) jungiasi su BCR genu (22 chromosoma) - chimeriniu BCR-ABL 1 genu. susidaro Metafazinė plokštelė su Filadelfijos chromosoma. Chromosomos yra nudažytos mėlynai, ABL 1 lokusas yra raudonas, o BCR lokusas yra žalias. Viršuje kairėje – pertvarkyta chromosoma, pažymėta raudonai žaliu tašku.

Daugiaspalvis FISH yra spektrinis kariotipų nustatymas, kurį sudaro chromosomų dažymas fluorescencinių dažų rinkiniu, kuris jungiasi prie konkrečių chromosomų sričių. Dėl tokio dažymo homologinės chromosomų poros įgauna identiškas spektrines charakteristikas, o tai labai palengvina tokių porų identifikavimą ir tarpchromosominių translokacijų aptikimą, tai yra pjūvių judėjimą tarp chromosomų - perkeltos sekcijos turi spektrą, kuris skiriasi nuo spektro. likusios chromosomos dalies.

46 kariotipas, XY, t(1; 3)(p 21; q 21), del(9)(q 22) Translokacija tarp 1 ir 3 chromosomų, 9 chromosomos delecija. Chromosomų sričių žymėjimą suteikia tiek skersinių ženklų kompleksai (klasikinis kariotipas, dryžiai), tiek fluorescencinis spektras (spalva, spektrinis kariotipavimas).