Клеточное старение. Старение клеток

Последние два-три года стали для геронтологии буквально прорывными. Сначала ученые нашли способ продлить жизнь дрожжей, червей и даже мышей с помощью голодания, потом – несколько генов, способных продлить активное долголетие. Удалось даже обнаружить связь между развитием половой системы, жировой ткани и продолжительностью жизни.

Но подход к молекулярным и клеточным основам старения не менялся уже несколько десятилетий: накопление мутаций, неизбежно возникающих при делении, постепенное разрушение белков и истощение «резервных» систем.

Мартин Хетцер из Института биологических исследований Салка и его коллеги смогли существенно уточнить это понимание :

За общими словами об изнашивании скрывается как минимум нарушение работы ядерных пор, обеспечивающих избирательный обмен содержимым между ядром и клеткой.

Несмотря на микроскопические размеры – от пяти до сотни микрометров, клетка сама включает ещё нескольких десятков органелл, главная среди которых – ядро, обеспечивающее регуляцию всех внутриклеточных и даже внеклеточных процессов. Внутри ядра, которое может занимать до 80% объема (у сперматозоидов), располагается самое ценное – генетическая информация, зашифрованная в последовательности ДНК.

Если бы не ядерная оболочка, то количество мутаций и сбоев в считывании кода просто бы не дало возможности клетке жить. Но несмотря на двойную мембрану, окружающую хромосомы,

Генетический аппарат не находится в изоляции: различные виды РНК постоянно покидают ядро, регулируя синтез белка, в то время как внутрь проникают сигналы, активирующие транскрипционные факторы.

Как и в случае с более «крупными» барьерами, работающими на уровне всего организма, ядерный тоже обладает избирательной проницаемостью: например, жирорастворимые молекулы, будь то стероидные гормоны или определенные лекарственные вещества, легко проникают через саму мембрану, больше похожую на тонкую масляную пленку с вкраплениями.

А вот нуклеиновые кислоты, белки и другие гидрофильные соединения обречены проходить через специальные каналы – ядерные поры. Несмотря на многообразие пропускаемых молекул, сами поры достаточно консервативно устроены у большинства организмов и состоят из внутреннего канала и симметричных наружных частей, похожих на расположенные в вершинах восьмиугольника белковые молекулы.

Как показали Хетцер и соавторы публикации в Cell, со временем эти поры начинают «течь», что и становится причиной более «заметных» последствий – отложения амилоидных бляшек вдоль сосудов мозга, разрушения хрящей в суставах, «одряхления» сердца.

На примере мышечных клеток, а потом – и всего организма нематоды C. elegans ученые продемонстрировали, что периферическая часть ядерного канала регулярно обновляется, в то время как центральная перестраивается только во время деления клеток, при котором оболочка ядра сначала разрушается, а потом образуется вновь. Соответственно, ядерные поры постепенно «изнашиваются», но, в отличие от других внутриклеточных систем, не обновляются, что и приводит к «протечке». В результате в ядро попадают не только мутагены, но и другие молекулы, нарушающие работу генетического аппарата.

Если дело касается постоянно обновляющихся клеток кожи или эпителия кишечника, то такой проблемы не возникает, но как быть нервным или мышечным клеткам, практически не делящимся на протяжении всей жизни? Неудивительно, что их обмен веществ завязан не только на «сигналы» из ядра, но и на устоявшиеся каскады реакций, не требующих быстрого вмешательства генетического аппарата.

Открытие Хетцера не стало очередной «самодостаточной» гипотезой в теории старения. Ученые продемонстрировали, как активные формы кислорода, давно ставшие главным врагом геронтологов, способны ускорять изнашивание ядерных пор, а вместе с этим и старение всей клетки. Остается надеяться, что система, компенсирующая эти «протечки», всё же существует, и если удастся её обнаружить, то это станет новым витком в изучении активного долголетия.

Несмотря на универсальность, процессу старения трудно дать четкое определение. С возрастом происходят физиологические и структурные изменения почти во всех системах органов. При старении имеют большое значение генетические и социальные факторы, характер питания, а также связанные с возрастом болезни - атеросклероз, сахарный диабет, остеоартроз. Повреждения клеток, обусловленные возрастом, также являются важным компонентом старения организма.

С возрастом прогрессивно страдает ряд функций клеток. Снижается активность окислительного фосфорилирования в митохондриях, синтеза ферментов и рецепторов клеток. Стареющие клетки обладают сниженной способностью к поглощению питательных веществ и восстановлению хромосомных повреждений. К морфологическим изменениям в стареющих клетках относятся неправильные и дольчатые ядра, полиморфные вакуолизирован-ные митохондрии, уменьшение эндоплазматической сети и деформация пластинчатого комплекса. Одновременно происходит накопление пигмента липофусцина.

Старение клеток является многофакторным процессом. Он включает эндогенные молекулярные программы клеточного старения, а также экзогенные влияния, приводящие к прогрессирующему вторжению в процессы выживаемости клеток.

Феномен клеточного старения интенсивно изучается в опытах in vitro. Показано, что в стареющих клетках происходит активация специфических для старения генов, повреждаются гены - регуляторы роста, стимулируются ингибиторы роста, а также включаются и другие генетические механизмы.

Предполагают, что генные дефекты могут быть обусловлены телометрическим укорочением хромосом. Теломеры играют важную роль в стабилизации терминальных порций хромосом и прикреплении их к ядерному матриксу. Например, длина теломе-ров уменьшается в последних пассажах культуры клеток и в культуре клеток людей старческого возраста. Обнаружена связь между длиной теломера и активностью теломеразы.

Приобретенные повреждения клеток при старении возникают под действием свободных радикалов. Причинами этих повреждений может быть воздействие ионизирующей радиации или прогрессирующее снижение активности антиоксидантных механизмов защиты, например витамина Е, пероксидазы глютатиона. Повреждение клетки свободными радикалами сопровождается накоплением липофусцина, однако сам по себе пигмент не токсичен для клетки. Кроме того, СПОЛ и свободные радикалы вызывают повреждение нуклеиновых кислот как в ядре, так и митохондриях. Мутации и уничтожение митохондриальной ДНК с возрастом становятся просто драматическими. Свободные радикалы кислорода катализируют также образование модификаций белков, включая ферменты, делая их чувствительными к повреждающему действию нейтральных и щелочных протеаз, содержащихся в цитозоле, что ведет к дальнейшему нарушению функций клетки.

Посттрансляционные изменения внутриклеточных и внеклеточных белков также возникают с возрастом. Одна из разновидностей таких изменений - неферментное гликозилирование белков. Например, связанное с возрастом гликозилирование белков хрусталика лежит в основе старческой катаракты.

Наконец, имеются данные о нарушении образования стрес-сорных белков in vitro у экспериментальных животных при старении. Образование стрессорных белков - важнейший механизм защиты от различных стрессов.

Резюмируя изложенный выше материал, возникает необходимость поставить несколько вопросов, ответы на которые позволят создать более полное представление, как о проблеме старения клеток, так и о старении организма в целом.

Первый вопрос можно сформулировать следующим образом: является ли теломеразный механизм единственным фактором, вызывающим старение соматических клеток? Если под термином «старение клеток» понимать только остановку митоза, то это, очевидно, не так. Вспомним, хотя бы, о том, что блокада митоза клеток может включаться и в клетках, длина теломер которых еще не достигла критического уровня. Так происходит в клетках, получивших в силу тех или иных причин нерепарированное повреждение ДНК. Как известно, в этих случаях активация гена р53 и других родственных ему по функции генов приводит к блокаде митоза и инициации процесса апоптоза. Эти же явления имеют место и в случае малегнизации клетки. Таким образом, становится ясно, что для организма наиболее важно избавится от поврежденных клеток, способных в случае их выживания дать клон клеток с нарушенными свойствами и функциями, что может грозить непредсказуемыми последствиями (например, образованием злокачественной опухоли). Следовательно, уничтожение путем апоптоза клеток, достигших лимита Хейфлика, это только частный случай сохранения морфологического и функционального гомеостаза организма, так как в длительно живущих и многократно делящихся клетках возможно накопление метаболических ошибок и повреждение генома.

Второй вопрос звучит так: является ли теломеразный механизм старения клеток фактором, определяющим старение организма в целом? Вряд ли на этот вопрос можно ответить положительно. Сошлемся на некоторые известные факты. У 90-летних доноров брались фибробласты, которые в культуре делились всего на 20 раз меньше, чем эмбриональные фибробласты. Как известно, лимит Хейфлика равен 50. Таким образом, у людей практически достигших (по современным представлениям) возраста, по продолжительности весьма близкого к предельному сроку жизни представителей человечества, лимит Хейфлика далеко не исчерпан. Более того, можно привести высказывание самого Л.Хейфлика, который писал: «…я не верю в то, что старение и смерть людей наступает вследствие прекращения деления их клеток».

Судя по всему, генетический контроль продолжительности жизни клетки, основанный на контроле за числом ее митозов – это только один из механизмов, позволяющих исключить из соответствующей клеточной популяции долгоживущие клетки, которые за время своего существования (у человека – это многие десятилетия) возможно, сумели в результате суммации молекулярных и метаболических ошибок приобрести признаки вредные для существования организма. Современная геронтологическая наука говорит о том, что старение организма и смерть его от старости – это результат очень многих системных изменений, объяснить которые невозможно только с точки зрения теломеразной теории старения клеток. К сожалению, теломераза – это только очередная «панацея» в долгой истории поисков человечеством средств продления жизни.

В данном обзоре изложены механизмы репликативного старения соматических клеток млекопитающих, влияние старых клеток на окружающие ткани и организм человека, патологии, связанные с дисфункциями теломер.

Введение.

Клетки, вошедшие в состояние репликативного старения, характеризуются набором биологических маркеров. Наиболее очевидным маркером является арест клеточного цикла в G1 фазе. Арест клеточного цикла при репликативном старении - процесс необратимый в том смысле, что даже ростовые факторы не могут стимулировать клетки к делению. Старые клетки сохраняют метаболическую активность и могут оставаться жизнеспособными, по существу, бесконечно долго. Важным компонентом этой стабильности может служить устойчивость старых клеток к апоптозу .

Вдобавок к необратимому аресту клеточного роста старые клетки претерпевают характерные изменения в морфологии : становятся более крупными, плоскими и гранулированными. В литературе эти клетки часто характеризуют по экспрессии в них связанной со старением b-галактозидазы , активной при рН 6. Лизосомальная гидролаза -галактозидаза в норме активна при рН 4. Когда клетки в культуре входят в состояние репликативного старения, увеличивается количество клеток, в которых -галактозидаза активна при рН 6.

Не так давно учеными были обнаружены более специфические биологические маркеры для определения репликативного старения, которые можно разделить на несколько категорий. (1) Компоненты сигнальных путей, которые индуцируют и поддерживают состояние старения (например, индукция ингибиторов циклин-зависимых киназ р16 и р21); (2) маркеры генотоксического стресса (такие как, очаги повреждения ДНК и их колокализация с теломерами); (3) появление характерного типа факультативного гетерохроматина , ассоциированного со старением; (4) секреция определенных воспалительных цитокинов и факторов, модифицирующих ткань.

В классическом варианте термин <репликативное старение > применяется для описания необратимого ареста клеточного цикла, связанного с дисфункцией теломер , в частности с их укорочением. Однако в последнее время ученые все чаще используют этот термин в более широком смысле. А именно, применяют этот термин для описания стресс-индуцированного старения. Объясняется это тем, что определенные виды стрессов могут индуцировать дисфункциональность теломер, в том числе и их укорочение, что в свою очередь приводит к тем же механизмам, что и при классическом репликативном старении. В данном компасе будут описаны механизмы клеточного старения, связанного с дисфункциональностью теломер, то есть механизмы репликативного старения в классическом его варианте.

Теломеры - важнейшие элементы генома.

Теломеры - это специализированные концевые структуры хромосом , состоящие из ДНК и белков. Теломеры позволяют клеткам отличать концы хромосом от двойных разрывов ДНК . Открытые концы хромосом подвергаются деградации, рекомбинации или склеиванию за счет репарации ДНК . Деградация хромосом ведет к потере генетической информации и, если не предотвратить этот процесс, то к клеточной гибели. Рекомбинация может привести к перестройкам, либо к уменьшению, либо к увеличению длины теломер, что может преждевременно запустить или, наоборот, приостановить старение клетки. Склеивание теломер приводит к образованию дицентрических хромосом (хромосома с двумя центромерами), которые разрушаются в течение митоза, порождая дополнительные двуцепочечные разрывы ДНК и нестабильность генома в целом. Таким образом, без теломер генетическая информация может утрачиваться, претерпевать перестройки или становиться нестабильной.

Вследствие ряда процессов (например, повреждения ДНК, многократных делений клетки в отсутствии активной теломеразы , изменения белков, ассоциированных с теломерой) теломеры могут утрачиваться или становиться нефункциональными. В ответ на нефункциональные или поврежденные теломеры клетки могут умереть, состариться, что сопровождается арестом клеточного цикла, или приобрести ряд мутаций . Подобные эффекты, безусловно, могут вызвать сильные последствия для всего организма, особенно для сложных организмов, которые содержат как митотические, так и постмитотические клетки. Сейчас доподлинно известно, что нефункциональные теломеры могут способствовать развитию опухоли . Однако при развитии опухоли для того, чтобы выжить раковые клетки должны приобрести механизмы стабилизации и восстановления теломерной функции. С другой стороны, существуют доказательства того, что нефункциональные теломеры могут способствовать старению клеток и индуцировать развитие возрастных патологий, таких как сосудистые заболевания, слабое заживление ран и иммунологическое старение . Более того, в определенных тканях стабилизация теломер может, при некоторых условиях, предотвращать или замедлять развитие ассоциированных со старением процессов.

Состав и структура теломер. Теломерная ДНК.

Теломеры млекопитающих состоят из простой последовательности 5 -TTAGGG-3 , повторяющейся сотни и тысячи раз на каждом конце хромосомы. Большинство участков теломер являются двуцепочечными ДНК, но конец каждой теломеры представляет собой одноцепочечный 3 G-хвост . Этот хвост является субстратом для теломеразы, клеточной обратной транскриптазы , которая может добавлять теломерную ДНК к концу хромосомы. Структура теломеры защищает G- хвост от деградации и, в некоторой степени, от нерегулируемого удлинения теломеразой.

Длина TTAGGG участков варьирует от вида к виду. Например, человеческие теломеры имеют размер 10-15 kb (килобаз), а лабораторные мыши (Mus musculus) имеют теломеры более длинные (>30kb) и более гетерогенные. С другой стороны, теломеры родственного вида мышей (Mus spretus) немногим короче, чем у людей. Длина теломер также варьирует в разных соматических клетках одного организма.

Важна ли общая длина теломеры для ее функционирования? Сравнение продолжительности жизни разных видов жиовтных показало, что длина теломеры не оказывает большого влияния на старение клеток или организма. Так, Homo sapiens и Mus spretus имеют теломеры практически одинаковой длины, но при этом существенно отличаются по скорости развития опухолей и срокам наступления старения. Наоборот, лабораторные мыши Mus musculus имеют более длинные теломеры, чем их дикие сородичи Mus spretus, тем не менее, все эти виды имеют практически одинаковую продолжительность жизни. Вероятно, что теломерная функция скорее зависит от структуры в целом, чем исключительно от ее длины.

Было идентифицировано несколько белков, которые ассоциированы с теломерами млекопитающих. Они регулируют структуру и контролируют длину теломер. Некоторые связаны исключительно с теломерами, тогда как другие локализуются в других ядерных или клеточных компартментах .

У млекопитающих два белка, TRF1 и TRF2, напрямую и специфически связаны с двуцепочечной теломерной ДНК, а третий белок, POT1, специфически связан с одноцепочечным G-хвостом. TRF2 и POT1 особенно важны для стабилизации структуры теломеры и защиты концов хромосом от деградации и слипания. Два дополнительных ассоциированных с теломерой белка у млекопитающих, TIN2 и hRAP1 также специфически локализованы на теломере, но не напрямую, а за счет связывания с TRF1 и TRF2, соответственно. Эти белки вместе с TRF1 контролируют длину теломер. Они не действуют подобно теломеразе, а скорее регулируют теломерную структуру и, поэтому, способны открывать доступ теломеразе к G-хвосту. TRF1, hRAP1 и TIN2 также помогают стабилизировать структуру теломеры.

Две неклассических поли-АДФ рибоз-полимеразы (PARP), TANK1 и TANK2, ферменты, обычно ассоциированные с репарацией ДНК и сохранением стабильности хромосом, также взаимодействуют с TRF1. Их роль в сохранении структуры и функциональности теломер пока не до конца изучена.

Недавно было обнаружено, что несколько известных белков, участвующих в репарации ДНК, также локализуются вблизи теломер. Одним из примеров является Ku, компонент ДНК-зависимой протеин киназы (DNA-PK), связывающий концы ДНК, который важен для репарации двуцепочечных разрывов путем негомологичного соединения концов (NHEJ). Таким образом, DNA-PK, помимо ее роли в репарации ДНК, может играть роль в сохранении теломер. Эта идея подтверждается недавно полученными данными, показывающими, что DNA-PK совместно с TRF2 необходимы для специфичного процессинга теломер после их репликации в S фазе . Более того, комплекс RMN , важный для репарации ДНК, может функционировать вблизи теломеры. У млекопитающих этот комплекс связан с теломерами, по крайней мере, в течение S фазы.

Структура теломеры.

Недавно было показано, что концы теломер представляют собой большую петлю, наподобие лассо, которая называется t петлей. Теломерные t петли были выделены из мышей, людей и простейших, что свидетельствует об их эволюционно консервативной структуре. У мышей и людей размер t петли коррелирует с длиной теломеры, варьируя от 3 kb в нормальных человеческих лимфоцитах до 18 kb в мышиных клетках печени. Простейшие , напротив, имеют t петли меньшего (1 kb) размера, несмотря на длину теломер 10-20 kb.

Формирование теломерных t петель зависит от TRF2. Кроме этого, формирование и/или сохранение теломерных t петель стабилизируется за счет других ассоциированных с теломерой белков, особенно за счет TRF1 и TIN2. Каким же образом t петли защищают теломеры от деградации и склеивания и регулируют длину теломер? Известно, что G-хвост утоплен в теломерную двуцепочечную ДНК в месте соединения t петли и хвоста. Таким образом, t петля может обеспечивать структуру, которая лишена распознаваемых <концов> ДНК и поэтому не имеет сходства с двуцепочечными разрывами. Она также может защищать G-хвост от деградации и ограничивать доступ теломеразы к ее субстрату. Разрушение t петли приводит к клеточному ответу, который, по крайней мере, в некоторых случаях имеет сходство с клеточным ответом на двойные разрывы ДНК.

Молекулярные механизмы репликативного старения.

Теломеры укорачиваются с каждым циклом удвоения генома, то есть при каждом клеточном делении. Минимальная скорость укорочения теломер в человеческих клетках составляет 30-50 пар оснований на каждое деление. Прогрессивное укорочение теломер приводит, в конечном счете, к урезанию теломер до критической длины или вызывает изменения в структуре теломер, что приводит к потере теломер-связывающих белков и впоследствии к активации процесса старения. Подтверждением такой гипотезы может служить тот факт, что дополнительная экспрессия каталитической субъединицы теломеразы (TERT) может предотвращать укорочение теломер и отменять арест клеточного роста, опосредованный старением. Напротив, было обнаружено, что ингибирование теломеразы в иммортализованных клетках ограничивает их репликативный срок жизни. Однако большинство клеток не экспрессируют теломеразу и отвечают на дисфункцию теломер необратимым арестом клеточного цикла.

Механизмы, по которым распознаются укороченные теломеры и активируется программа старения, пока не до конца понятны. Было предложено несколько гипотез влияния укорочения теломер на старение, включая индукцию ответа на повреждения ДНК и активацию обычно молчащих <генов старения>, локализованных в субтеломерных участках.

Учеными были предприняты огромные усилия для того, чтобы объяснить молекулярные механизмы старения. Так, были идентифицированы гены, экспрессия которых изменяется при старении клеток. Однако до сих пор, не доказано являются ли эти изменения экспрессии генов причиной или следствием старения. Исследования молекулярных механизмов старения осложняются тем фактом, что старение не является уникальным клеточным процессом. Механизмы старения существенно отличаются у клеток, полученных из различных видов животных. Так, например, в отличие от человеческих фибробластов, мышиные фибробласты экспрессируют теломеразу и имеют очень длинные теломеры, однако после нескольких пассажей в культуре мышиные фибробласты начинают стареть, что не зависит от укорочения теломер и, возможно, опосредуется окислительным стрессом. Даже разные типы клеток, полученные из одного и того же животного, могут существенно различаться по механизмам старения. Человеческие фибробласты начинают стареть после ограниченного числа клеточных делений в культуре, а экспрессия теломеразы отменяет этот процесс. Напротив, человеческие эпителиальные клетки молочной железы быстро переходят в состояние ареста клеточного роста, которое не связано с укорочением теломер, но опосредуется активацией ингибитора циклин-зависимых киназ р16. Субпопуляция клеток с инактивированным р16 выходит из состояния ареста и продолжает делиться до наступления вторичного ареста клеточного роста, который на этот раз уже связан с укорочением теломер. Эти отличия являются отражением различий в экспрессии ряда генов в этих старых клетках, что говорит о том, что существует множество путей старения. Различные пути старения, тем не менее, сходятся на двух белках p53 и pRb.

Пути репликативного старения.

р53-р21 путь.

Исследования, в которых с использованием разных подходов подавлялась активность или экспрессия р53 , четко установили его специфическую роль в старении. Инактивация р53 способна задерживать, хотя и не отменять, репликативное старение в человеческих клетках. В старых клетках р53 мРНК и уровни белка по большому счету не изменяются, но р53 становится фосфорилированным и его активность, как транскрипционного фактора , повышается в процессе старения. Каким образом р53 активируется за счет укорочения теломер, пока остается неясным. Недавно полученные результаты свидетельствуют о том, что критически короткие теломеры, утратившие свою структуру и связь с регуляторными белками, индуцируют клеточный ответ, такой же, как индуцируется на повреждения ДНК, что приводит к активации ATM/ATR и Chk1/Chk2, которые, в свою очередь, приводят к фосфорилированию и активации р53.

Одной из мишеней р53 является ингибитор циклин-зависимых киназ, р21 . Экспрессия р21 повышается в процессе репликативного старения, и его активация зависит от сигналов, инициируемых укорочением теломер, поскольку экспрессия TERT блокирует эту активацию. Было обнаружено, что экспрессия р21 в течение репликативного старения регулируется по двум механизмам, р53-зависимому и р53-независимому. Гиперэкспрессия р21 индуцирует арест клеточного роста в некоторых клетках, тогда как делеция р21 может отсрочивать арест, связанный со старением. Совместно эти исследования говорят о том, что функции р53 в старении заключаются, по крайней мере, частично, в индукции р21.

р16-pRb путь.

Обнаружение маркеров, ассоциированных со старением, в местах развития возрастных патологий дает дополнительные основания предполагать о наличии связи между клеточным старением и старением организма. Несколькими группами исследователей были представлены доказательства присутствия старых эндотелиальных клеток в атеросклеротических бляшках . Изменения экспрессии генов в старых клетках являются факторами развития атеросклероза. Также была обнаружена связь между клеточным старением и другим возрастным заболеванием, остеоартрозом . Старые клетки обнаруживались в кластерах хондроцитов вблизи остеоартрического повреждения. В норме уровень обновления хондроцитов в хряще низок, но он увеличивается при развитии заболевания, что в свою очередь способствует изнашиванию теломер. Характерным заболеванием пожилых мужчин является доброкачественная гиперплазия простаты , которая характеризуется ростом зоны перехода простаты вследствие пролиферации эпителиальных и стромальных клеток. Интересно, что эта пролиферация происходит из-за наличия старых эпителиальных клеток, обнаруженных в этой области. Эти клетки секретируют цитокины ИЛ-1 и ИЛ-8, которые стимулируют секрецию стромальных факторов роста, что в свою очередь индуцирует пролиферацию нестарых эпителиальных клеток. Таким образом, присутствие старых клеток может способствовать прогрессированию соседних предраковых клеток и, следовательно, развитию рака в старых тканях.

С другой стороны, как было упомянуто выше, клеточное старение может защитить организм млекопитающих от опухоли. Однако если клеточное старение также способствует старению организма, вероятно, что это является примером эволюционно антагонистической плейотропии. Эта теория предполагает, что некоторые особенности, которые в процессе эволюции развивались, как защитные механизмы многоклеточных организмов, в частности млекопитающих, оптимальны для молодых организмов, но могут иметь вредное влияние на старые организмы. Арест клеточного цикла, связанный с клеточным старением, может быть той самой особенностью, которая подавляет развитие опухоли в молодых индивидуумах. Напротив, измененные функции старых клеток могут оказывать вредные воздействия на пожилые организмы. По-видимому, эти вредные эффекты также присутствуют и в молодых тканях, однако, в связи с тем, что количество старых клеток в организме молодых индивидуумов невелико, их вредные воздействия не являются системными. Когда организм стареет, старые клетки накапливаются. Возможно, что накопление этих клеток с измененными функциями и секреторным профилем, приводит к физиологическим изменениям и к нарушению целостности ткани и организма в целом.

Секреторный профиль старых клеток может нарушать микроокружение ткани, которое важно для подавления роста и пролиферации клеток с онкогенными мутациями. Таким образом, повреждения, теломерная дисфункция или ошибки в митогенной сигнализации могут приводить к накоплению старых клеток, но их влияние может становиться значимым и вредоносным только в более позднем возрасте, когда они накопятся в достаточном количестве. Поскольку с возрастом количество клеток с онкогенными мутациями увеличивается, то вероятность их встречи со старыми клетками повышается у пожилых людей. Если это случается, старые клетки создают микроокружение, которое способствует усиленной пролиферации и злокачественной трансформации мутантных клеток. Таким образом, несмотря на защиту от опухоли в молодых организмах, клеточное старение, индуцированное дисфункцией теломер, может способствовать прогрессированию опухоли у старых организмов.

Репликативное старение как основной механизм развития преждевременного старения организма.

Было показано, что некоторые заболевания человека связаны с неадекватным укорочением теломер. Хотя подобные патологии могут в некоторой степени варьировать в своем проявлении, все они приводят к преждевременному старению и ранней гибели организма. В настоящее время известны три синдрома, причиной которых являются мутации в генах, кодирующих голоферменты теломеразы: врожденный дискератоз , апластическая анемия , и некоторые случаи идиопатического легочного фиброза . Пациенты, страдающие врожденным дискератозом, обладают маленьким ростом, страдают от недоразвития половой системы и бесплодия, имеют дефекты кожи и гемопоэтической системы и обычно умирают от недостатка клеток костного мозга. Многие из этих патологий также развиваются у мышей, нокаутных по теломеразе. Совсем недавно обнаруженный синдром, идиопатический легочный фиброз, является гипертрофическим летальным заболеванием, связанным с прогрессивным образованием рубцов в легких, вследствие чего развивается легочная недостаточность.
Также было показано, что человеческие сегментарные прогероидные синдромы связаны с клеточным старением, а клетки, полученные из таких пациентов, обычно обладают ограниченной жизнеспособностью in vitro. Наиболее изученными являются синдром Вернера , или прогерия взрослых, и синдром Хатчинсона-Гилфорда , или прогерия детей. Синдром Вернера является аутосомальным рецессивным расстройством, причиной которого служат мутации в гене WRN, кодирующем хеликазы семейства RecQ, которые вовлечены в репарацию ДНК и транскрипцию. Пациенты с синдромом Вернера проявляют фенотип старых людей, для которого характерны поседение волос, плешивость, двусторонняя катаракта, диабет 2 типа, недоразвитие половой системы, остеопороз и атеросклероз; продолжительность жизни таких пациентов составляет в среднем не более 47 лет, причиной смерти обычно является развитие рака или заболевание сосудов. Синдром Хатчинсона-Гилфорда является аутосомальным доминантным расстройством, причиной которого служит мутация в гене LMNA, кодирующем ламин А/С, что приводит к экспрессии сплайсингового варианта прогерина. Пациенты, страдающие синдромом Хатчинсона-Гилфорда, также проявляют фенотип старых людей, включая очень маленький рост, характерные особенности старости на лице, утрату волос, липодистрофию, склеродермию, остеолиз и атеросклероз; гибель наступает в среднем в возрасте 12 лет, как результат инфаркта миокарда или инсульта. Хотя генетические дефекты при синдроме Вернера и синдроме Хатчинсона-Гилфорда различны, были представлены доказательства, что в обоих случаях усиленное клеточное старение связано с повышенной скоростью укорочения теломер.

Синдром Вернера

Заключение.

Более чем 45 лет назад были сделаны важнейшие открытия в понимании молекулярных механизмов старения клеток. Однако до сих пор остаются вопросы, на которые наука затрудняется ответить. Одним из основных вопросов по сей день является необходимость поиска биологических маркеров, с помощью которых можно было бы безошибочно отличить клетку, находящуюся в состоянии репликативного старения, от нормальной клетки в стадии покоя. Параметры, которые в настоящее время используются для этих целей весьма неспецифичные. Как было сказано выше, они включают необратимый арест клеточного роста, изменения в морфологии (уплощение, увеличение и гранулированность клеток), а также позитивное окрашивание на -галактозидазу, ассоциированную со старением, активную при рН6. Однако, что касается морфологических признаков, они весьма субъективны. Экспрессия же -галактозидазы, активной при рН6, возможна вследствие не только старения, но и других процессов, протекающих в клетке и ткани. Поэтому необходим однозначный и специфический маркер или маркеры, и до тех пор, пока не появится такой маркер, сложно будет корректно определить наличие и количество старых клеток in vivo. Благодаря недавно полученным результатам по оценке экспрессии генов, для ученых, изучающих старение, открылись новые возможности для того, чтобы идентифицировать и охарактеризовать специфические маркеры старения.

Изучение роли клеточного старения в многообразии возрастных патологий становится все более востребованной темой. Как обсуждалось выше, неоспоримые экспериментальные доказательства сейчас существуют и показывают связь между повышенной скоростью клеточного старения и усиленным старением организма. Степень, с которой клеточное старение способствует природной продолжительности жизни разных видов животных, сейчас остается неустановленной. Вероятно, что клеточное старение является одним из нескольких (или многих?) факторов, которые влияют или способствуют старению организма.

За исключением р53-р21 и р16-pRb путей, немного известно о компонентах генетических путей старения. Было идентифицировано множество генов, экспрессия которых изменяется в старых клетках, но остается неизвестным, являются ли эти изменения в генной экспрессии причиной или следствием процесса старения. Идентификация и характеристика новых генетических компонентов путей старения сможет обеспечить понимание молекулярных механизмов старения, а также предоставить необходимые инструменты для модулирования путей старения in vivo. Имея возможность манипулировать процессами старения in vivo, можно будет предотвращать или хотя бы замедлять развитие патологических состояний, связанных с возрастными изменениями организма.

8. Chen J.-H., Hales C.N., Ozanne S.E. "DNA damage, cellular senescence and organismal ageing: causal or correlative?"

9. Campisi J. "Senescent cells, tumor suppression and organismal ageing: good citizens, bad neighbors".

10. Jeyapalan J.C., Sedivy J.M. "Cellular senescence and organismal aging".

11. Shay J.W., Wright W.E. "Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase".

Старение клеток (cell senescence) является событием, которое происходит во всех нормальных клетках in vitro (доля таких клеток в организме невелика). Клетки, растущие в культуре, имеют ограниченную продолжительность жизни и не растут после определенного числа делений. Они прекращают делиться и в конце концов умирают. В соответствии с этим ожидаемая продолжительность жизни в установленной культуре клеток зависит от возраста донора. Клетки, приобретшие бессмертие, через кризисный период трансформации за счет воздействия химических веществ или вирусов, точно так же, как линии злокачественных клеток в целом, обладают способностью делиться неопределенно долго. Другая форма клеточной смерти, или программируемая клеточная смерть, происходит во многих физиологических ситуациях, например, при дифференцировке кератиноцитов.

Наука о старении клеток называется цитогеронтология. Продолжительность жизни нормальных диплоидных клеток в культуре ограничена, находится под генетическим контролем и ее можно модифицировать(гормонами, факторами роста и др.).

Большинство клеток млекопитающих при помещении в культуру претерпевают ограниченное число клеточных делений перед тем, как переходят в нечувствительное непролиферирующе состояние, называемое старением. Однако, несколько путей, которые активируются по одиночке или совместно могут помочь клеткам обойти старение по крайней мере на ограниченные периоды времени. Они включают теломеразный путь, требующийся для поддержания теломерных концов, и пути p53 и Rb, требующиеся для направления старения в ответ на повреждения ДНК, сокращение теломер и митогенные сигналы, и путь инсулиноподобного ростового фактора, который может регулировать продолжительность жизни и клеточную пролиферацию. Для борьбы с клеточным старением теломеразу необходимо реактивировать, а p53 и Rb подавлять. Эмбриональные бессмертны, потому что эти пути в них строго регулируются.

Таким образом, клетки, растущие в культуре, имеют ограниченную продолжительность жизни и не растут после определенного числа делений. Продолжительность жизни нормальных диплоидных клеток в культуре находится под генетическим контролем и ее можно модифицировать(гормонами, факторами роста и др.).

Стареющие клетки могут длительно сохранять жизнеспособность. Это показывает, что процесс старения четко отличается от любой формы смерти клеток, например апоптоза, и что эти состояния необходимо различать. Старение обнаружено у многих типов клеток человека и других млекопитающих. Эти данные (см. обзор Cristofalo, ea 1993) показывают, что старение является общим феноменом. Наблюдения, свидетельствующие, что фенотип старения доминирует над иммортализованным фенотипом (Bunn, ea 1980 , Muggleton-Harris, ea 1980 , Pereira-Smith, ea 1981 , Pereira-Smith, ea 1983), многими авторами интерпретировались в том смысле, что ограниченная продолжительность жизни нормальных клеток является генетически запрограммированным процессом и что иммортализованные клетки теряют функцию одного или более предполагаемых генов старения, которые активны в нормальных клетках.

Подробнее о репликативном старении клеток можно прочитать в

Старение клетки- старение организма?

Все клетки организма продуцируют специфические вещества- , с помощью которых передается сигнал, запускается пролиферация, дифференцировка, апоптоз и др. Особенное значение этому придает тот факт, что некоторые клетки- фибробласты-расположены по всему организму, окружают многие клетки. Вполне возможно, что возрастные изменения в синтезе и ответе этих клеток на различные цитокины приводят к старению других клеток организма. А так как эти клетки повсюду, то стареет весь организм. Об этом свидетельствует работа Jeyapalan JC и Sedivy JM из Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University . В августе этого года вышла их статья "Старение клеток и старение организма" .
Клеточное старение (senescence) впервые было обнаружено в культурах клеток и представляет собой необратимую остановку клеточного цикла,
запускаемую различными факторами. Существуют доказательства того, что старение- это некий экстренный механизм для защиты от образования опухоли-клетка стареет и не может делиться, а опухолевые клетки, как известно, характеризуются безконтрольным ростом и делением. Но также известно, что старение клеток может приводить к опухолевому процессу и вносит свой вклад в старение всего организма. Накопление стареющих клеток приводит к старению организма вцелом. Многие клетки модифицируют свое окружение, а окружение влияет на другие клетки. При старении этих клеток, в основном фибробластов, изменяется и окружение других клеток, что может приводить к их старению.

Возраст-зависимые мутации мтДНК и клеточное старение

Мутации митохондриальной ДНК (мтДНК)- одна из причин возраст-зависимого разрушения клеток, вызываемая в свою очередь действием (АФК). Но не для всех этих мутаций доказано значение для клеточного старения. Ученые из Университета Ньюкасла под руководством профессора Mark Birch-Machin занимаются исследованием фенотипического значения мутации T414G (замена T на G в 414 положении) внутри контрольного региона мтДНК, наличие которой показано в стареющей (в том числе и при фотостарении) коже (). Исследователи продемонстрировали, что в течении деления фибробласта кожи in vitro в 5 различных культурах клеток, выделенных у пожилых людей, груз мутации T414G может увеличиваться или уменьшаться при клеточном делении, что свидетельствует об отсутствии направленного отбора против этой мутации. В подтверждение этого, с помощью клеточного сортера было показано, что уровень мутации T414G прямо не коррелирует со снижением или повышением числа копий мтДНК, или с маркерами клеточного старения (накопление липофусцина, продукция АФК). По видимому, распределение мутации косвенно зависит от типа клеточной линии. Ученые пришли к выводу, что эта мутация имеет небольшое влияние на продукцию АФК и клеточное старение в культуре фибробластов.
Подобные исследования причин и звеньев патогенеза клеточного старения имеют большое значение для разработки методов борьбы со старением.

Старение эндотелиальных прогениторных клеток

Фактор роста гепатоцитов (hepatocyte growth factor (HGF)) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor (VEGF)) -потенциально ангиогенные факторы роста в животных моделях ишемии , но их характеристики не одинаковы в лабораторных и клинических исследованиях. Японские ученые, в том числе знаменитый профессор Ryuichi Morishita из Университета Осаки, поставили целью своего исследования изучить действие этих ростовых факторов на эндотелиальные прогениторные клетки с помощью стимуляции ангиотензином II, который известен как фактор риска развития атеросклероза (). В результате исследования было выяснено, что HGF, но не VEGF, смягчает ангиотензин II-индуцированное старение эндотелиальных прогениторных клеток через снижение , ингибируя фосфатидилинозитол-трифосфат/rac1 путь. Мощная индукция неоваскуляризации HGF, но не VEGF, с помощью ангеотензина II была подтверждена экспериментами in vivo с использованием различных моделей, в том числе и трансгенных по HGF мышей.
Исследование причин, механизмов и факторов, противодействующих клеточному старению, с использованием различных подходов помогает геронтологам и ученым других специальностей искать средства для борьбы с процессом старения.

p53

Белок контролирует правильность выполнения генетических программ организма- он участвует в развитии ответа на стресс, может инициировать репарацию ДНК, остановку клеточного цикла, клеточное старение, а, прежде всего, - . До сих пор невыяснено каким именно образом p53 влияет на процесс старения- через запуск апоптоза, через остановку репарации и регенерации, или через все вышеупомянутые механизмы. Исследования на мышах дают разные, часто противоречивые результаты. Но одно несомненно- клеточное старение и старение организма в целом связаны с функционированием p53 . Этому посвящена статья ученых из The Institute for Advanced Study, Princeton Vazquez A , Bond EE, Levine AJ и Bond GL "Генетика сигнального пути p53, апоптоз и терапия рака" .
Ответ на стресс определяет индивидуальные возможности формирования опухоли и ответ на различные типы терапии онкологических заболеваний. Ученые занимаются оптимизацией терапии в соответствии современному уровню знаний. Для этого они провели генетическое исследование компонентов сигнального пути p53- самого p53 и его негативного регулятора MDM2, который может стать мишенью для терапии. Кроме того, унаследованные однонуклеотидные полиморфизмы генов сигнального пути p53 могут приводить к сходным результатам.
Из всего вышесказанного следует очень важный вывод: исследование влияния p53 на клеточное старение и запуск апоптоза помогают в разработке и оптимизации борьбы с онкологическими заболеваниями, большая часть которых является спутниками старости.

Старение клеток мезотелия

Группа польских ученых из Медицинского Университета Познани , в том числе и профессор Университета Ньюкасла исследовала уязвимость для и различные типы старения человеческих перитонеальных мезотелиальных клеток (). Выделенная из асцитической жидкости линия клеток LP-9 и выделенная из сальника линия мезотелиальных клеток HOMCs широко используются в различных исследованиях. Предполагается, что in vitro они обладают разным репликативным потенциалом. Исследователи решили сравнить эти клеточные линии с целью выявления конкретных механизмов клеточного старения . Обнаружено, что HOMCs делится меньше и вступает в фазу старения раньше, чем LP-9. Этот эффект был подтвержден ранним повышением уровня бэта-галактозидазы, ассоциированной со старением, и ингибиторов клеточного цикла p16(INK4A) и p21(WAF1). Кроме того, все 3 раза, когда клетки пересевали наблюдалось увеличение уровня повреждения ДНК. В отличие от LP-9, у HOMCs области повреждения локализовались в основном вне и длина теломер уменьшалась незначительно в процессе старения клеток. По сравнению с клетками LP-9, HOMCs входит в фазу старения с гораздо меньшим уровнем липофусцина и повреждения ДНК, а также с характерным низким уровнем восстановленного глутатиона. Кроме того, HOMCs синтезирует гораздо больше активных форм кислорода спонтанно или в ответ на внешние оксиданты. Результаты говорят о том, что в отличие от LP-9, HOMCs подвергается стресс-индуцированному теломеро-независимому преждевременному старению, что может быть следствием сильной уязвимости для .
Это исследование наглядно показывает, что разные клетки стареют по-разному.

Старение Т-клеток у приматов

В результате ряда исследований обнаружены серьезные возрастные изменения функционирования Т-лимфоцитов. В то время как общее количество Т-клеток в периферической крови в старости заметно не изменяется, наблюдаются четкие различия в относительном количестве подтипов Т-клеток. Количество незрелых лимфоцитов Т-предшественников увеличивается с возрастом, так же как и процент частично активированных Т-лимфоцитов, несущих маркеры незрелого фенотипа тимуса . Имеет место относительное увеличение цитотоксических супрессорных Т-клеток и уменьшение количества хелперов/индукторов Т-клеток. Функциональные дефекты клеточно-опосредованного иммунитета коррелируют с уменьшением популяции хелперов/индукторов. Клетки, полученные от старых людей или лабораторных животных, менее способны к ответу на аллогенные лимфоциты, фитогемагглютинин, конканавалин А и растворимый антиген. Лимфоциты от более старых мышей обладают меньшей способностью вызывать реакции отторжения, чем те, которые получены от более молодых особей тех же инбредных линий. Половина здоровых людей в возрасте старше 50 лет страдают кожной гиперчувствительностью. Уменьшение количества хелперов/индукторов Т-клеток и функций клеточно-опосредованного иммунитета сопровождается ростом количества антител и аутоиммунных реакций.

Онковирусы и арест клеточного цикла

Другой вариант старения клеток иммунной системы связан с инфицированием онковирусами . Инфицирование человеческим Т-лимфотропным вирусом типа1 (HTLV-1) вызывает дисрегуляцию пролиферации Т-лимфоцитов, что приводит к Т-клеточной лимфоме. Ранние клеточные изменения после инфицирования HTLV-1 трудно исследовать, т.к. для передачи вируса нужен межклеточный контакт, а в культуре клетки мало контактируют друг с другом. В Департаменте Микробиологии и Иммунологии Uniformed Services University of the Health Sciences ученые под руководством профессора Chou-Zen Giam провели исследования, в ходе которых показано, что клетки линии HeLa прекращают пролиферацию через 1-2 деления после инфицирования HTLV-1 или встраивания вирусного гена tax (). Клетки HeLa, инфицированные вирусом, как и клетки с встроенным tax, характеризуются высоким уровнем экспрессии p21(CIP1/WAF1) и p27(KIP1), митотическими аномалиями, останавливаются в G1-фазе клеточного цикла и стареют. Для сравнения, клетки человеческой остеосаркомы (HOS) продолжают делиться, хотя и с уменьшением скорости роста и отклонениями митоза. В клетках HOS значительно снижается экспрессия p21 и p27, которые ассоциированы с активацией пути фосфатидилинозитол-3-протеинкиназы (PI3K). Снижение p21(CIP1/WAF1) и p27(KIP1) в HOS вероятно позволяет произойти индуцированному вирусом или его геном аресту. Наконец, инфицирование HTLV-1 и экспрессия Tax вызывает арест в G1-фазе и клеток другой линии- Т-лимфоцитов SupT1. Отсюда вывод: инфицирование HTLV-1 приводит к вызываемому tax аресту клеточного цикла. Кроме того, Т-клетки, содержащие мутации по p21(CIP1/WAF1) и p27(KIP1) могут продолжать пролиферировать после инфицирования. Эти инфицированные клетки могут
размножаться, накапливать хромосомные аберрации и прогрессировать, приводя к раку.

Инсулиноподобный фактор роста (ИФР) и клеточное старение

С возрастом у людей возникают проблемы с опорно-двигательным аппаратом, в том числе и из-за патологических изменений в межпозвоночных дисках. У пожилых людей в дисках много стареющих клеток . Стареющие клетки не могут делиться и это снижает способность ткани диска к обновлению, чтобы заменить клетки погибшие некрозом или апоптозом . Ученые из Carolinas Medical Center, Charlotte под руководством Эдварда Хенли (Edward Hanley) провели работу по исследованию старения клеток межпозвоночных дисков и методов воздействия на него (). Целями данного исследования были:
1) создание надежной лабораторной модели стресс-индуцированного
преждевременного старения человеческих клеток межпозвоночных дисков;
2) определить потенциал ИФР1 в качестве средства против клеточного старения in vitro.
Инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР1) опосредует эффекты соматотропного гормона (СТГ). ИФР1 производится гепатоцитами печени в ответ на стимуляцию их соматотропиновых рецепторов. В периферических тканях именно ИФР-1 обеспечивает практически все физиологические эффекты соматотропного гормона.
Для создания модели использовали 2-часовую обработку перекисью водорода, затем с помощью иммуноцитохимических методов определяли локализацию стареющих клеток по бета-галактозидазе, процентное содержание стареющих клеток в культуре оценивали после 3 дней культивирования. Было создано 9 культур из хирургического
материала от 8 пациентов, клетки которых тестировались ИФР1 с
концентрацией 0, 50, 100 и 500 нг/мл. ИФР с концентрацией 50 и 100 нг/мл слабо незначительно на процент стареющих клеток, значительное снижение процента стареющих клеток наблюдалось при обработке ИФР с концентрацией 500 нг/мл. Эти данные являются этапом разработки терапевтичеких средств для борьбы с клеточным старением, в том числе и клеток межпозвоночных дисков.

Ресвератрол и лечение глаукомы

Ресвератрол- это фитоалексин (антибиотик, вырабатываемый в растениях, подвергшихся заражению). Он вырабатывается во многих растениях в ответ на действие бактериальных патогенов и патогенов грибов. Сейчас его получают искусственно и используют как пищевую добавку. Было показано, что он увеличивает продолжительность жизни у экспериментальных организмов- дрожжей и мышей.
Paloma Liton , Pedro Gonzalez , David L. Epstein , а также сотрудники их лабораторий из DUKE EYE CENTER Duke University Medical Center провели исследование эффекта ресвератрола при лечении глаукомы .
Повышенное внутриглазное давление (intraocular pressure (IOP)) является главным фактором риска для возникновения открытоуголной глаукомы (primary open-angle glaucoma (POAG)), которая составляет более 90% случаев глаукомы-тяжелого возраст-ассоциированного заболевания глаз. Высокое внутриглазное давление возникает из-за снижения оттока внутриглазной жидкости через систему трабекул (TM) Шлеммова канала. Снижение функции ТМ при POAG ассоциированна с экспрессией маркеров воспаления, старением клеток, и снижением клеточности. В настоящее время лечние глаукомы заключается в снижении давления, но этот терапевтический подход не улучшает функционирование ТМ у больных глаукомой. Ученые провели исследования действия ресвератрола на экспрессию маркеров воспаления, оксидативное повреждение и старения клеток ТМ, подтвергающихся хроническому оксидативному стрессу. Ресвератрол снижает продукцию внутри клеток и маркеров воспаления (IL1alpha, IL6, IL8 и ELAM-1), а также маркеров старения (бэта-галактозидазы, липофусцина и ). Также ресвератрол обладает антиапоптотическим действием, не ассоциированным со снижением клеточной пролиферации. Был сделан вывод, что ресвератрол предотвращает аномалии клеток ТМ у больных глаукомой.

В заключение

Процесс клеточного старения многообразен. Он запускается различными факторами, идет через разные сигнальные пути. В разных клетках процесс старения различен, наступает в разные моменты времени. Но во в любом случае приводит к дисфункции и смерти клетки. При рассмотрении клеточного старения возникает несколько вопросов, которые мы частично попытались рассмотреть:
1) Насколько клеточное старение соответствует старению организма в целом?
2) Как происходит старение разных клеточных типов?
3) Чем отличается старение клеток в организме (in vivo) и в лабораторных условиях (in vitro)?
4) Как старение клеток влияет на функцию клеток?
5) Как можно повлиять на процесс клеточного старения?
6) Каковы перспективы использования регуляции клеточного старения в терапии возраст-ассоциированных заболеваний?
Ответы на эти и другие вопросы очень важны для разработки средств борьбы со старением. Это один из фундаментальных механизмов, лежащих в основе старения человека.