rumah › Enjin › Kajian kaedah sitogenetik. Kaedah genetik

Kajian kaedah sitogenetik. Kaedah genetik

Kaedah sitogenetik (karyotip, karyotip). digunakan terutamanya dalam kajian karyotype individu individu.

Intipati kaedah ini adalah untuk mengkaji struktur kromosom individu, serta ciri-ciri set kromosom sel manusia dalam kesihatan dan penyakit. Objek yang mudah untuk ini ialah limfosit, sel epitelium bukal dan sel lain yang mudah diperoleh, ditanam dan tertakluk kepada analisis karyologi. Ini adalah kaedah penting untuk menentukan jantina dan penyakit keturunan kromosom pada manusia.

Asas kaedah sitogenetik adalah kajian morfologi kromosom individu sel manusia. Tahap pengetahuan semasa tentang struktur kromosom dicirikan oleh penciptaan model molekul struktur nuklear yang paling penting ini dan kajian tentang peranan komponen kromosom individu dalam penyimpanan dan penghantaran maklumat keturunan.

Perubahan dalam karyotype biasanya dikaitkan dengan perkembangan penyakit genetik. Terima kasih kepada penanaman sel manusia, adalah mungkin untuk mendapatkan bahan yang cukup besar untuk penyediaan ubat dengan cepat. Untuk karyotyping, budaya jangka pendek leukosit darah periferal biasanya digunakan.

Kaedah sitogenetik juga digunakan untuk menggambarkan sel interfasa. Sebagai contoh, dengan kehadiran atau ketiadaan kromatin seks (badan Barr, yang merupakan kromosom X yang tidak aktif), adalah mungkin bukan sahaja untuk menentukan jantina individu, tetapi juga untuk mengenal pasti beberapa penyakit genetik yang berkaitan dengan perubahan dalam bilangan kromosom X. .

Kaedah ini membolehkan anda mengenal pasti karyotype (ciri struktur dan bilangan kromosom) dengan merekodkan karyogram. Kajian sitogenetik dijalankan ke atas proband, ibu bapanya, saudara mara atau janin jika sindrom kromosom atau gangguan kromosom lain disyaki.

Karyotaip– kaedah sitogenetik – membolehkan untuk mengenal pasti penyelewengan dalam struktur dan bilangan kromosom yang boleh menyebabkan kemandulan, penyakit keturunan lain dan kelahiran anak yang sakit.

Dalam genetik perubatan, dua jenis karyotyping utama adalah penting:

mengkaji karyotype pesakit
karyotyping pranatal - kajian kromosom janin

Kaedah sitogenetik untuk mengkaji genetik manusia. Penentuan X- dan Y-kromatin. Kepentingan kaedah untuk mendiagnosis penyakit kromosom yang berkaitan dengan pelanggaran bilangan kromosom seks dalam karyotype.

Penentuan X- dan Y-kromatin sering dipanggil kaedah diagnostik nyata jantina. Sel-sel mukosa mulut, epitelium faraj atau folikel rambut diperiksa. Dalam nukleus sel wanita dalam set diploid terdapat dua kromosom X, salah satunya tidak aktif sepenuhnya (berspiral, padat padat) sudah pada peringkat awal perkembangan embrio dan kelihatan dalam bentuk gumpalan heterochromatin yang melekat pada membran nuklear. Kromosom X yang tidak aktif dipanggil kromatin seks atau badan Barr. Untuk mengesan X-chromatin seksual (badan Barr) dalam nukleus sel, calitan diwarnakan dengan asetarsein dan sediaan dilihat menggunakan mikroskop cahaya konvensional. Biasanya, wanita mempunyai satu ketulan X-chromatin, tetapi lelaki tidak mempunyainya.

Untuk mengenal pasti kromatin jantina-Y lelaki (badan-F), calitan diwarnakan dengan kina dan dilihat menggunakan mikroskop pendarfluor. Y-kromatin dikesan sebagai titik bercahaya kuat, berbeza dalam saiz dan keamatan daripada kromocenter lain. Ia terdapat dalam nukleus sel dalam badan lelaki.

Ketiadaan badan Barr pada wanita menunjukkan penyakit kromosom - sindrom Shereshevsky-Turner (karyotype 45, X0). Kehadiran badan Barr pada lelaki menunjukkan sindrom Klinefelter (karyotype 47, XXY).

Penentuan X- dan Y-chromatin ialah kaedah saringan; diagnosis akhir penyakit kromosom dibuat hanya selepas mengkaji karyotype.

Kaedah sitogenetik

Kaedah sitogenetik digunakan untuk mengkaji karyotype manusia biasa, serta untuk mendiagnosis penyakit keturunan yang berkaitan dengan mutasi genomik dan kromosom.
Di samping itu, kaedah ini digunakan untuk mengkaji kesan mutagenik pelbagai bahan kimia, racun perosak, racun serangga, dadah, dll.
Semasa tempoh pembahagian sel pada peringkat metafasa, kromosom mempunyai struktur yang lebih jelas dan tersedia untuk kajian. Set diploid manusia terdiri daripada 46 kromosom:
22 pasang autosom dan sepasang kromosom seks (XX - pada wanita, XY - pada lelaki). Biasanya, leukosit darah periferal manusia diperiksa dan diletakkan dalam medium nutrien khas di mana ia membahagi. Kemudian persediaan disediakan dan bilangan dan struktur kromosom dianalisis. Pembangunan kaedah pewarnaan khas telah sangat memudahkan pengecaman semua kromosom manusia, dan dalam kombinasi dengan kaedah genealogi dan kaedah kejuruteraan selular dan genetik, ia telah memungkinkan untuk mengaitkan gen dengan bahagian tertentu kromosom. Aplikasi bersepadu kaedah ini mendasari pemetaan kromosom manusia.

Kawalan sitologi diperlukan untuk diagnosis penyakit kromosom yang berkaitan dengan mutasi ansuploidi dan kromosom. Yang paling biasa ialah penyakit Down (trisomi kromosom ke-21), sindrom Klinefelter (47 XXY), sindrom Shershevsky-Turner (45 XO), dll. Kehilangan bahagian salah satu kromosom homolog pasangan ke-21 membawa kepada penyakit darah - leukemia myeloid kronik.

Kajian sitologi nukleus interfasa sel somatik boleh mengesan apa yang dipanggil badan Barr, atau kromatin seks. Ternyata kromatin seks biasanya terdapat pada wanita dan tiada pada lelaki. Ia adalah hasil daripada heterokromatisasi salah satu daripada dua kromosom X pada wanita. Mengetahui ciri ini, adalah mungkin untuk mengenal pasti jantina dan mengesan bilangan kromosom X yang tidak normal.

Pengesanan banyak penyakit keturunan adalah mungkin walaupun sebelum kelahiran seorang kanak-kanak. Kaedah diagnosis pranatal terdiri daripada mendapatkan cecair amniotik, di mana sel janin terletak, dan penentuan biokimia dan sitologi seterusnya kemungkinan anomali keturunan. Ini membolehkan anda membuat diagnosis pada peringkat awal kehamilan dan membuat keputusan mengenai penerusan atau penamatan.

Sitogenetik ialah cabang bebas kajian tentang keturunan, yang mengkaji pelbagai, terutamanya pembawa yang boleh diperhatikan (eksplisit) yang mengandungi maklumat tentang keturunan genetik. Pembawa sedemikian adalah kromosom pelbagai jenis (politena, mitosis dan meiotik), plastid, nukleus interfasa, dan, pada tahap yang lebih rendah, mitokondria.

Berdasarkan ini, kaedah sitogenetik adalah satu set kaedah dan teknologi untuk mengkaji, pertama sekali, kromosom, di mana parameter kuantitatif mereka ditubuhkan, penerangan kimia dan biologi mereka dibuat, dan struktur dan mod tingkah laku semasa pembahagian sel adalah belajar. Tugas saintifik kajian ini adalah untuk mewujudkan hubungan antara sifat dan dinamik perubahan dalam struktur kromosom dan gambar yang mencerminkan kebolehubahan sifat.

Salah satu bidang penyelidikan yang paling penting yang melibatkan kaedah sitogenetik ialah analisis karyotype manusia. Kajian ini biasanya dijalankan pada kultur di mana pembahagian kuman dan sel somatik berlaku.

Budaya yang paling biasa untuk jenis penyelidikan ini ialah sel darah periferal seperti limfosit, fibroblas dan sel sumsum tulang. Budaya yang paling mudah diakses digunakan dalam sitogenetik perubatan ialah limfosit darah. Sebabnya ialah, sebagai peraturan, mereka adalah subjek analisis dan dalam kes janin, kaedah sitogenetik melibatkan penggunaan kultur sel, pilihannya ditentukan oleh beberapa faktor. Yang utama ialah tempoh kehamilan. Sebagai contoh, dengan tempoh kurang daripada 12 minggu ini, analisis sitogenetik kromosom paling baik dilakukan dengan penyertaan sel chorion, dan dengan tempoh kehamilan lebih daripada 12 minggu, adalah dinasihatkan untuk mempertimbangkan sel-sel janin itu sendiri untuk penyelidikan. . Untuk tujuan ini, mereka diasingkan khas daripada plasenta dan darah janin.

Untuk menubuhkan karyotype, keturunan sitogenetik memerlukan mendapatkan sampel darah dalam jumlah sekurang-kurangnya 1-2 ml. Selain itu, kaedah itu sendiri melibatkan menjalankan penyelidikan yang terdiri daripada tiga peringkat utama:

Pengasingan dan di mana analisis akan dijalankan;

Mewarna penyediaan;

Menjalankan analisis menyeluruh ubat di bawah mikroskop.

Kaedah sitogenetik genetik boleh berkesan hanya apabila syarat berikut dipenuhi. Pertama, mesti ada bilangan sel tertentu yang berada dalam peringkat metafasa. Kedua, penanaman mesti dijalankan mengikut peraturan yang ditetapkan dan untuk tempoh sekurang-kurangnya 72 jam. Ketiga, penetapan sel harus dilakukan dengan larutan metanol dalam nisbah ketat bahan-bahan ini 3: 1.

Pada peringkat mewarna penyediaan, pilihan warna dibuat dengan mengambil kira tujuan kajian, iaitu jenis penyusunan semula yang perlu dikaji. Selalunya, kaedah pewarnaan berterusan digunakan, kerana ia adalah yang paling mudah untuk menentukan parameter kuantitatif kromosom. Penyelidikan moden kebanyakannya menggunakan kaedah pewarnaan ini untuk menentukan keabnormalan karyotype dalam ekspresi kuantitatif mereka. Tetapi kaedah sitogenetik ini tidak memungkinkan untuk menentukan dan mendedahkan dinamik struktur kromosom. Oleh itu, kaedah khas lain digunakan yang memungkinkan untuk meneutralkan kelemahan kaedah pewarnaan berterusan ini. Yang paling biasa daripada mereka, seperti kaedah pewarnaan yang dibezakan, kaedah G, kaedah R dan lain-lain.

Dan akhirnya, peringkat ketiga kajian terdiri daripada pemeriksaan mikroskopik kromosom berwarna yang berada di peringkat metafasa. Semasa itu, bilangan sel normal dan abnormal dalam badan janin manusia ditentukan. Untuk melakukan ini, sebagai peraturan, beberapa tisu dianalisis.

Untuk menentukan karyotype, kedua-dua kaedah penyelidikan langsung dan tidak langsung digunakan. Dalam kes pertama, bahan yang diambil dari sumsum tulang, nodus limfa, tisu embrio, korion, sel cecair amniotik atau tisu lain dikaji sejurus selepas penerimaan. Walau bagaimanapun, kaedah langsung adalah bermaklumat hanya apabila bahan mengandungi bilangan metafasa mitosis yang mencukupi, kerana hanya dalam fasa ini kromosom memperoleh ciri-ciri struktur yang wujud dan pengecaman yang tepat adalah mungkin. Pada masa ini, kaedah penyelidikan tidak langsung digunakan secara meluas.

Kaedah untuk menyediakan plat metafasa. Kultur yang diambil (limfosit darah periferi, dsb.) diletakkan dalam medium nutrien untuk penanaman. Biasanya, mitosis limfosit tidak diperhatikan dalam darah periferal, oleh itu ubat (phytohemagglutinin) digunakan yang merangsang transformasi imunologi limfosit dan pembahagiannya. Peringkat kedua ialah penangkapan pembahagian sel mitosis pada peringkat metafasa. Ini dicapai dengan menambahkan colchicine atau colcimed pada kultur tisu 2-3 jam sebelum tamat kultur. Pada peringkat ketiga, menggunakan larutan hipotonik kalsium klorida atau natrium sitrat, hipotonik sel dicapai, akibatnya sel membengkak, pecah membran nuklear, ikatan interchromosomal dipecahkan, dan kromosom terapung bebas dalam sitoplasma. Seterusnya, kultur yang terhasil difikatkan dengan campuran metanol dan asid asetik, disentrifugasi dan fiksatif ditukar. Suspensi dengan fiksatif digunakan pada slaid kaca bersih, di mana plat metafasa diluruskan dan kromosom individu terletak di dalamnya. Apabila fiksatif mengering, sel dilekatkan dengan kuat pada kaca. Oleh itu, tanpa mengira kultur sel dari mana plat metafasa diperoleh, prinsip umum untuk mendapatkan persediaan adalah seperti berikut: pengumpulan metafasa, hipotonisasi, penetapan, jatuh ke atas slaid kaca.

Mewarna penyediaan. Pewarnaan sediaan adalah peringkat seterusnya selepas mendapatkan plat metafasa dan dibahagikan kepada mudah, dibezakan dan pendarfluor. Setiap jenis pewarnaan digunakan untuk mengesan hanya perubahan tertentu dalam karyotype. Dengan pewarnaan mudah (kaedah pewarnaan Giemsa), hanya pengenalpastian kumpulan kromosom boleh dilakukan, jadi kaedah ini digunakan untuk penentuan anggaran anomali karyotype berangka. Pewarnaan mudah digunakan secara meluas untuk mengkaji mutagenesis kromosom apabila menguji faktor persekitaran untuk mutasi. Pewarnaan Giemsa mengotorkan semua kromosom secara sama rata di sepanjang keseluruhan panjangnya, sambil mengkontur sentromer, satelit dan penyempitan sekunder. Pewarnaan pembezaan adalah disebabkan oleh keupayaan untuk mengotorkan secara selektif sepanjang panjang dan dipastikan oleh kesan garam suhu yang agak mudah pada kromosom tetap. Dalam kes ini, pembezaan struktur kromosom sepanjang panjang diturunkan, dinyatakan dalam bentuk selang-seli kawasan eu- dan heterochromatic (gelap dan terang), yang khusus untuk setiap kromosom, lengan dan rantau yang sepadan. G-stain adalah yang paling biasa digunakan. Dalam kes ini, kromosom dirawat terlebih dahulu dengan larutan protease atau garam. Untuk mengkaji proses mutasi pada manusia, kaedah pewarnaan pembezaan kromatid kakak digunakan secara meluas, berdasarkan keupayaan analog thymidine-5-bromodeoxyuridine untuk dimasukkan ke dalam urutan replikasi kromosom. Kawasan kromosom yang termasuk analog ini diwarnakan dengan buruk, jadi menggunakan kaedah ini, sebarang susunan semula kromosom atau kromosom boleh dikenal pasti.

Kajian kromatin seks. Kaedah untuk menentukan kromatin jantina adalah lebih cepat dan mudah daripada mengkaji set kromosom (karyotype), jadi ia digunakan sebagai salah satu ujian saringan untuk tinjauan populasi jisim. Biasanya, dalam sel-sel badan wanita, dengan kaedah pewarnaan tertentu, badan yang sangat bernoda terbentuk berhampiran membran nuklear - kromatin seks, atau badan Barr, yang dibentuk oleh satu kromosom X yang tidak aktif. Kromosom X yang lain aktif dalam sel-sel badan wanita. Lelaki hanya mempunyai satu kromosom X, dan ia sentiasa aktif, jadi kromatin seks tidak dikesan dalam nukleus sel badan lelaki. Untuk mengkaji kromatin X seks, pengikisan biasanya diambil dari mukosa mulut. Kaedah ekspres yang paling biasa ialah pewarnaan Sanders menggunakan larutan 2% asid asetik acetoorcein diikuti dengan mikroskop rendaman. Di samping itu, dalam neutrofil darah matang, apa yang dipanggil drumstick juga dikesan, dan badan kromatin dan drumsticks adalah kurang satu daripada bilangan kromosom X. Dalam neutrofil pada lelaki, pembentukan perinuklear dalam bentuk "benang" dan "rambut" juga dikesan. Kehilangan kromosom X yang tidak aktif pada wanita menyebabkan ketiadaan kromatin seks. Penampilan kromosom X tambahan pada seorang lelaki membawa kepada pembentukan badan kromatin seks.

Petunjuk untuk pemeriksaan sitogenetik pesakit:

1) pelbagai kecacatan perkembangan (melibatkan tiga atau lebih sistem); gangguan yang paling kekal ialah kecacatan otak, sistem muskuloskeletal, jantung dan sistem genitouriner;
2) terencat akal dalam kombinasi dengan gangguan perkembangan fizikal, displasia, hipogenitalisme;
3) ketidaksuburan primer yang berterusan pada lelaki dan wanita dengan pengecualian patologi ginekologi dan urologi;
4) keguguran berulang, terutamanya pada peringkat awal;
5) pelanggaran perkembangan seksual (hipogonadisme, penyongsangan seksual);
6) berat kecil kanak-kanak yang dilahirkan semasa kehamilan penuh.

Penggunaan kaedah sitogenetik dalam genetik klinikal telah membawa kepada perkembangan arah baru - sitogenetik klinikal, yang membolehkan:

- mewujudkan asal usul kromosom yang disusun semula secara struktur dan pengelasan tepatnya;
- mengenal pasti sindrom yang disebabkan oleh ketidakseimbangan dalam bidang kromosom individu;
- mengumpul maklumat tentang perubahan kromosom dalam sel tumor, pada pesakit dengan penyakit darah keturunan, dsb.

Asas kaedah ini adalah kajian mikroskopik kromosom. Kajian sitologi telah digunakan secara meluas sejak awal 20-an. abad XX. mengkaji morfologi kromosom, mengkultur leukosit untuk mendapatkan plat metafasa.

Perkembangan sitogenetik manusia moden dikaitkan dengan nama ahli sitologi D. Tio dan A. Levan. Pada tahun 1956, mereka adalah orang pertama yang mengesahkan bahawa manusia mempunyai 46 kromosom, yang menandakan permulaan kajian luas kromosom mitosis dan meiotik manusia.

Pada tahun 1959, saintis Perancis D. Lejeune, R. Turpin dan M. Gautier menubuhkan sifat kromosom penyakit Down. Pada tahun-tahun berikutnya, banyak sindrom kromosom lain yang biasa ditemui pada manusia telah diterangkan. Sitogenetik telah menjadi cabang perubatan praktikal yang paling penting. Pada masa ini, kaedah sitogenetik digunakan untuk mendiagnosis penyakit kromosom, menyusun peta genetik kromosom, mengkaji proses mutasi dan masalah lain genetik manusia.

Pada tahun 1960, Klasifikasi Antarabangsa Kromosom Manusia yang pertama telah dibangunkan di Denver. Ia berdasarkan saiz kromosom dan kedudukan penyempitan utama - sentromer. Semua kromosom dibahagikan mengikut bentuk kepada metasentrik, submetasentrik dan akrosentrik dan dibahagikan kepada 7 kumpulan, yang ditetapkan oleh huruf Latin A, B, C, D, E, F, G. Setiap pasangan kromosom diberikan nombor siri dari 1 hingga 22 , diserlahkan secara berasingan dan dinamakan dalam huruf Latin - kromosom seks X dan Y.

Pada tahun 1971, di Persidangan Genetik Prague, sebagai tambahan kepada klasifikasi Denver, kaedah untuk pewarnaan pembezaan kromosom telah dibentangkan, berkat setiap kromosom memperoleh corak uniknya sendiri, yang membantu dalam pengenalan yang tepat.

Maklumat asas tentang morfologi kromosom manusia diperolehi dengan mengkaji mereka dalam metafasa mitosis dan profase - metafasa meiosis. Adalah penting bahawa bilangan sel yang membahagi adalah tinggi. Kerja sitogenetik yang paling penting dilakukan pada limfosit darah periferal, kerana limfosit kultur selama 2-3 hari dengan kehadiran phytohemagglutinin memungkinkan untuk mendapatkan plat metaphase untuk analisis kromosom.

Plat metafasa satu lapisan dengan kromosom terletak berasingan tertakluk kepada analisis sitogenetik. Untuk melakukan ini, sel pembahagi dirawat dengan colchicine dan bahan kimia tertentu.

Peringkat penting analisis sitogenetik ialah pewarnaan sediaan yang terhasil. Ia dijalankan menggunakan kaedah pembezaan dan pendarfluor yang mudah.

Kemajuan dalam sitogenetik molekul manusia memungkinkan untuk membangunkan kaedah baru untuk mengkaji kromosom. Oleh itu, perlu diperhatikan kaedah penghibridan pendarfluor, yang memungkinkan untuk mengkaji pelbagai isu: dari penyetempatan gen kepada mentafsir penyusunan semula kompleks antara beberapa kromosom.

Oleh itu, gabungan kaedah genetik sitogenetik dan molekul dalam genetik manusia menjadikan kemungkinan untuk mendiagnosis keabnormalan kromosom hampir tidak terhad.

Sitogenetik ialah cabang genetik yang mengkaji corak keturunan dan kebolehubahan pada tahap sel dan struktur subselular, terutamanya kromosom. Kaedah sitogenetik direka untuk mengkaji struktur set kromosom atau kromosom individu. Asas kaedah sitogenetik adalah kajian mikroskopik kromosom manusia. Kaedah mikroskopik untuk mengkaji kromosom manusia mula digunakan pada akhir abad ke-19. Istilah "cytogenetics" diperkenalkan pada tahun 1903 oleh William Sutton.

Kajian sitogenetik telah digunakan secara meluas sejak awal 20-an. abad XX untuk mengkaji morfologi kromosom manusia, mengira kromosom, memupuk leukosit untuk mendapatkan plat metafasa. Pada tahun 1959, saintis Perancis D. Lejeune, R. Turpin dan M. Gautier menubuhkan sifat kromosom penyakit Down. Pada tahun-tahun berikutnya, banyak sindrom kromosom lain yang biasa ditemui pada manusia telah diterangkan. Pada tahun 1960, R. Moorhead et al. membangunkan kaedah untuk membiakkan limfosit darah periferal untuk mendapatkan kromosom metafasa manusia, yang memungkinkan untuk mengesan mutasi kromosom ciri penyakit keturunan tertentu.

Penggunaan kaedah sitogenetik: kajian karyotype manusia biasa, diagnosis penyakit keturunan yang berkaitan dengan mutasi genomik dan kromosom, kajian kesan mutagenik pelbagai bahan kimia, racun perosak, racun serangga, ubat-ubatan, dll. Objek kajian sitogenetik boleh membahagikan somatik, sel meiotik dan interfasa.

KAEDAH CYTOGENETIK Mikroskopi cahaya Mikroskopi elektron Mikroskopi konfokal Mikroskopi luminescence Mikroskopi pendarfluor

Petunjuk untuk kajian sitogenetik Kecurigaan penyakit kromosom berdasarkan simptom klinikal (untuk mengesahkan diagnosis) Kehadiran pelbagai kecacatan kongenital pada kanak-kanak yang tidak berkaitan dengan sindrom gen Pengguguran spontan berulang, kelahiran mati atau kelahiran kanak-kanak dengan kecacatan kongenital Reproduktif terjejas fungsi yang tidak diketahui asalnya pada wanita dan lelaki Terencat akal yang ketara dan perkembangan fizikal kanak-kanak

Diagnosis pranatal (mengikut umur, disebabkan kehadiran translokasi pada ibu bapa, semasa kelahiran anak terdahulu dengan penyakit kromosom) Kecurigaan terhadap sindrom yang dicirikan oleh ketidakstabilan kromosom Leukemia (untuk diagnosis pembezaan, penilaian keberkesanan rawatan dan prognosis rawatan) Penilaian kesan mutagenik pelbagai bahan kimia, racun perosak, racun serangga, ubat-ubatan, dsb.

Semasa tempoh pembahagian sel pada peringkat metafasa, kromosom mempunyai struktur yang lebih jelas dan tersedia untuk kajian. Biasanya, leukosit darah periferal manusia diperiksa dan diletakkan dalam medium nutrien khas di mana ia membahagi. Kemudian persediaan disediakan dan bilangan dan struktur kromosom dianalisis.

Kajian sitogenetik sel somatik Penyediaan persediaan kromosom mitosis Pewarnaan sediaan (mudah, pembezaan dan pendarfluor) Kaedah sitogenetik molekul - kaedah hibridisasi warna in situ (IKAN)

Kaedah sitogenetik yang digunakan dalam amalan klinikal termasuk: - kaedah karyotyping klasik; - kaedah sitogenetik molekul. Sehingga baru-baru ini, diagnosis penyakit kromosom adalah berdasarkan penggunaan kaedah tradisional analisis sitogenetik.

Untuk mengkaji kromosom, persediaan kultur darah jangka pendek paling kerap digunakan, serta sel sumsum tulang dan kultur fibroblas. Darah dengan antikoagulan disentrifugasi ke eritrosit sedimen, dan leukosit diinkubasi dalam medium kultur selama 2-3 hari. Phytohemagglutinin ditambah kepada sampel darah kerana ia mempercepatkan aglutinasi sel darah merah dan merangsang pembahagian limfosit. Fasa yang paling sesuai untuk mengkaji kromosom ialah metafasa mitosis, jadi colchicine digunakan untuk menghentikan pembahagian limfosit pada peringkat ini. Menambah ubat ini pada kultur meningkatkan bahagian sel yang berada dalam metafasa, iaitu pada peringkat kitaran sel apabila kromosom kelihatan paling baik. Setiap kromosom direplikasi dan, selepas pewarnaan yang sesuai, kelihatan sebagai dua kromatid yang dilekatkan pada sentromer, atau penyempitan pusat. Sel-sel tersebut kemudiannya dirawat dengan larutan natrium klorida hipotonik, tetap dan diwarnakan. Untuk mengotorkan kromosom, pewarna Romanovsky-Giemsa, 2% acetcarmine atau 2% acetarsein paling kerap digunakan. Mereka mengotorkan kromosom sepenuhnya, seragam (kaedah rutin) dan boleh digunakan untuk mengesan keabnormalan kromosom berangka

Klasifikasi kromosom manusia Denver (1960). Kumpulan A (1-3) - tiga pasang kromosom terbesar: dua metasentrik dan 1 submetasentrik. Kumpulan B – (4-5) – dua pasang kromosom submetasentrik panjang. Kumpulan C (6 -12) – 7 pasang autosom submetasentrik bersaiz sederhana dan kromosom X. Kumpulan D (13 -15) – tiga pasang kromosom akrosentrik sederhana. Kumpulan E (16 -18) – tiga pasang kromosom metasentrik dan submetasentrik. Kumpulan F (19 -20) - dua pasang kromosom metasentrik kecil. Kumpulan G (21 -22 dan Y) - dua pasang kromosom akrosentrik kecil dan kromosom Y.

1. Pewarna rutin (seragam) 2. Digunakan untuk menganalisis bilangan kromosom dan mengenal pasti gangguan struktur (penyimpangan). Dengan pewarnaan rutin, hanya sekumpulan kromosom boleh dikenal pasti dengan pasti; dengan pewarnaan pembezaan, semua kromosom boleh dikenal pasti

Idiogram kromosom manusia mengikut klasifikasi Denver dan Paris A B C E D F G

Kaedah pewarnaan pembezaan bagi pewarnaan kromosom Q - Pewarnaan Kaspersson dengan acrichiniprit dengan pemeriksaan di bawah mikroskop pendarfluor. Selalunya digunakan untuk mengkaji kromosom Y. Pewarnaan G ialah pewarnaan Romanovsky-Giemsa yang diubah suai. Kepekaan adalah lebih tinggi daripada pewarnaan Q, oleh itu ia digunakan sebagai kaedah standard untuk analisis sitogenetik. Digunakan untuk mengenal pasti penyimpangan kecil dan kromosom penanda (bersegmen berbeza daripada kromosom homolog biasa) Pewarnaan R - oren akridin dan pewarna serupa digunakan, dan kawasan kromosom yang tidak sensitif terhadap pewarnaan G diwarnakan. Pewarnaan C - digunakan untuk menganalisis kawasan centromeric kromosom yang mengandungi heterochromatin konstitutif. Pewarnaan T - digunakan untuk menganalisis kawasan telomerik kromosom.

Kawasan pemeluwapan kuat dan lemah di sepanjang panjang kromosom adalah khusus untuk setiap kromosom dan mempunyai keamatan warna yang berbeza.

Hibridisasi in situ (FISH) - karyotyping spektrum, yang terdiri daripada kromosom pewarnaan dengan set pewarna pendarfluor yang mengikat kawasan kromosom tertentu. Hasil daripada pewarnaan sedemikian, pasangan homolog kromosom memperoleh ciri spektrum yang sama, yang sangat memudahkan pengenalpastian pasangan tersebut dan pengesanan translokasi interchromosomal, iaitu, pergerakan bahagian antara kromosom - bahagian translokasi mempunyai spektrum yang berbeza daripada spektrum daripada baki kromosom.

Kacukan pendarfluor in situ (FISH) Pendarfluor in situ hibridisasi, atau kaedah FISH, ialah kaedah sitogenetik yang digunakan untuk mengesan dan menentukan kedudukan urutan DNA tertentu pada kromosom metafasa atau dalam nukleus interfasa in situ. Hibridisasi in situ pendarfluor menggunakan probe DNA (probe DNA) yang mengikat sasaran pelengkap dalam sampel. Probe DNA mengandungi nukleosida yang dilabelkan dengan fluorofor (pelabelan langsung) atau konjugat seperti biotin atau digoxigenin (pelabelan tidak langsung).

Penentuan translokasi t(9; 22)(q 34; q 11) dalam leukemia myeloid kronik melalui kaedah FISH, gen ABL 1 (kromosom 9) digabungkan dengan gen BCR (kromosom 22) - gen chimeric BCR-ABL 1 terbentuk Plat metafasa dengan kromosom Philadelphia. Kromosom berwarna biru, lokus ABL 1 berwarna merah, lokus BCR berwarna hijau. Di bahagian atas sebelah kiri ialah kromosom dengan penyusunan semula, ditandai dengan titik merah-hijau.

IKAN Multicolor ialah karyotyping spektrum, yang terdiri daripada kromosom pewarnaan dengan set pewarna pendarfluor yang mengikat kawasan kromosom tertentu. Hasil daripada pewarnaan sedemikian, pasangan homolog kromosom memperoleh ciri spektrum yang sama, yang sangat memudahkan pengenalpastian pasangan tersebut dan pengesanan translokasi interchromosomal, iaitu, pergerakan bahagian antara kromosom - bahagian translokasi mempunyai spektrum yang berbeza daripada spektrum daripada baki kromosom.

Karyotype 46, XY, t(1; 3)(p 21; q 21), del(9)(q 22) Translokasi antara kromosom pertama dan ketiga, pemadaman kromosom ke-9. Penandaan kawasan kromosom diberikan oleh kompleks tanda melintang (karyotaip klasik, jalur) dan oleh spektrum pendarfluor (warna, karyotaip spektrum).