Medicininė genetika. Žmogaus genomo dekodavimas Iššifruojant Drosophila genomą buvo nustatyta, kad

© M.D. Golubovskis

Nekanoniniai paveldimi pokyčiai

M.D. Golubovskis

Michailas Davidovičius Golubovskis, Biologijos mokslų daktaras, vadovaujantis mokslo darbuotojas
Rusijos mokslų akademijos Gamtos mokslų ir technologijos istorijos instituto Sankt Peterburgo filialas.

Genetika kaip mokslas susiformavo prieš 100 metų po antrinio Mendelio dėsnių atradimo. Spartus jo vystymasis pastaraisiais metais buvo pažymėtas daugelio dešimčių rūšių DNR genomo nukleotidų sudėties dekodavimu. Atsirado naujos žinių šakos – genomika, molekulinė paleogenetika. 2001 m. pradžioje, kaip brangios 10 metų tarptautinės programos dalis, buvo paskelbtas esminis žmogaus genomo dekodavimas. Šiuos pasiekimus galbūt galima palyginti su žmogaus išėjimu į kosmosą ir nusileidimu Mėnulyje.

Genų inžinerija ir biotechnologijos labai pakeitė mokslo veidą. Štai įdomus epizodas, jau įtrauktas į naujausią ataskaitą: „Po 1998 metų prasidėjo precedento neturinčios lenktynės tarp 1100 pasaulinės žmogaus genomo projekto bendruomenės mokslininkų ir privataus kapitalo įmonės „Celera Genomics“.. Įmonė tikėjosi būti pirmoji, pasiekusi finišą ir pasinaudojusi patentuotais žmogaus DNR fragmentais. Tačiau kol kas nugalėjo principas: „Tai, kas sukurta gamtos ir Dievo, negali būti patentuota žmogaus“.

Ar Gregoras Mendelis galėjo įsivaizduoti tokį fantasmagorišką vaizdą, kai jis metai iš metų lėtai vykdė savo eksperimentus vienuolyno sodo tyloje? Kiek tai keičia natūralią mokslo saviugdą? Ar visa genomų DNR analizė tikrai pašalina visus dangčius? Viltys, kad Pinokis jau rado brangų auksinį raktą nuo slaptų durų, susidūrė su nenumatyta realybe ir paradoksais. Žmonėms tik 3% genomo DNR koduoja baltymus, o gal dar 20-25% dalyvauja genų veikimo reguliavime. Kokia yra funkcija ir ar likusi DNR dalis turi tokią funkciją? Geno genai kartais lyginami su mažomis salelėmis neaktyvių ir galbūt „šiukšlių“ sekų jūroje. DNR rasė kartais primena posakį: „atnešk tai, aš nežinau ką“.

Skeptikų prieštaravimai jokiu būdu nepašalinami. Iš tiesų, taikant visišką seką, tam tikro DNR segmento priskyrimas (naudojant madingą terminą) „geno rangui“ atliekamas tik remiantis grynai formaliais kriterijais (genetiniais skyrybos ženklais, reikalingais transkripcijai). Daugumos „nominuotų genų“ vaidmuo, laikas ir veikimo vieta vis dar visiškai neaiškūs.

Tačiau yra ir kita problema. Genomu turime suprasti visą paveldimą sistemą, apimančią ne tik tam tikro DNR elementų rinkinio struktūrą, bet ir jų tarpusavio ryšių pobūdį, lemiantį ontogenezės eigą konkrečiomis aplinkos sąlygomis. Yra sisteminė triada: elementai, ryšiai tarp jų ir vientisumo savybės. Tai veda prie svarbios išvados: žinios apie genų struktūrą DNR lygiu yra būtinos, bet visiškai nepakankamos genomui apibūdinti. Esame tik ant dinamiško organizavimo metodo ir nekanoninių paveldėjimo formų suvokimo slenksčio [,].

Netikėtai, XX amžiaus pabaigoje. klausimas, kokios yra paveldimo kintamumo ribos ir spektras, peržengė grynai akademines diskusijas. Iš pradžių Anglijoje, o vėliau Vokietijoje galvijus teko skersti dėl neurodegeneracinės anomalijos, kuri žmonėms galėjo užsikrėsti per sergančių gyvulių mėsą. Paaiškėjo, kad infekcijos sukėlėjas buvo ne DNR ar RNR, o baltymai, vadinami prionais (iš anglų kalbos prions – protein infectious particles – protein infectious particles).

Tyrėjai pirmą kartą susidūrė su jų neįprastu pasireiškimu 60-aisiais. Bet tada jie bandė interpretuoti šį reiškinį klasikinių sąvokų rėmuose, manydami, kad tai yra „lėtos virusinės gyvūnų infekcijos“ arba specialus mielių slopintuvo mutacijų tipas. Dabar paaiškėja „Prionų reiškinys nėra egzotiškas žinduoliams būdingas reiškinys, o ypatingas bendro biologinio mechanizmo atvejis“ dinaminis paveldėjimas. Tikėtina, kad centrinė molekulinės genetikos dogma turės būti papildyta, kad būtų atsižvelgta į perdavimo tarp rūšių ir rūšių viduje galimybę pagal infekcijos tipą.

Devintojo dešimtmečio pradžioje molekulinės biologijos ir genetikos klasikas R.B.Khesinas nustatė tris nekanoninio paveldimo kintamumo formas: neatsitiktinius lokusų ir chromosomų sričių pokyčius, susidedančius iš DNR pasikartojimų; citoplazminių savybių pasikeitimas ir paveldėjimas; epigenetinis vietinių ir bendrųjų chromatino pakuotės pokyčių paveldėjimas. Tada buvo pridėti mobilieji genai, kurių elgesys sukėlė genomo kintamumo problemą.

Šio straipsnio tikslas – parodyti, kad skirtingos ne Mendelio paveldėjimo formos yra ne išimtis, o bendresnių idėjų apie genomo organizavimą pasekmė. Paveldimi pokyčiai jokiu būdu neapsiriboja tik mutacijomis.

Andre Lvovas ir jo atradimo vaidmuo

Nuostabaus atsitiktinumo dėka tais pačiais 1953 metais pasirodė du straipsniai, nusakę šiuolaikinės genetikos veidą: J. Watson ir F. Crick atrado dvigubą DNR spiralę ir A. Lvovas (1902-1994), kuris, mano nuomone, dabar yra ne mažiau svarbus biologijai, medicinai ir genetikai nei dviguba DNR spiralė.

Lvovas nustatė, kad fagas gali būti integruotas į bakterijos chromosomą ir perduodamas per daugelį kartų kaip įprastas bakterijų genas. Šioje būsenoje fage veikia tik represoriaus genas, kuris blokuoja visų kitų jo lokusų darbą. Bakterija, kuri į savo genomą įtraukė fagą, vadinama lizogenine, o integruotas fagas vadinamas profagu. Tokia lizogeninė bakterija yra apsaugota nuo kitų fagų infekcijos. Veikiamas ultravioletinių spindulių ar ląstelės vidinės aplinkos pokyčių, represorius inaktyvuojamas, blokada pašalinama, fagas dauginasi, sukeldamas ląstelių mirtį. Dabar net sunku įsivaizduoti, koks revoliucinis buvo šis atradimas.

Andre Lvovas yra kilęs iš Rusijos, jo tėvai 19 amžiaus pabaigoje emigravo į Prancūziją. Mokslininko motinos Marijos Siminovič atvaizdas amžinai įamžintas dailininko V. Serovo drobėje „Mergina apšviesta saulės“ (1888). Marija Jakovlevna Lvova-Siminovič gyveno 90 metų. Likus kelioms savaitėms iki Antrojo pasaulinio karo, ji Tretjakovo galerijai padovanojo V. Serovo laiškus ir piešinius. Lvovo tėvas pažinojo Mechnikovą ir nuvedė sūnų pas jį į Pastero institutą. Taip kultūros gijos driekiasi ir persipina per šimtmečius ir šalis. Per savo ilgą gyvenimą A.Lvovas paeiliui dirbo protozoologu, bakteriologu, biochemiku, genetiku ir galiausiai virusologu. Pastero institute jis globojo ir J. Monodą, ir F. Jacobą, kuris su meistru už operono atradimą pasidalino 1965 m. Nobelio premiją.

Jau nuo 20-ųjų buvo žinomos bakterijų padermės, kurios tariamai neša fagus latentinėje būsenoje ir karts nuo karto sukelia ląstelių lizę. Tačiau bakteriofagijos atradėjas F.D. Herrelis žiūrėjo į fagą tik kaip į ląstelėms mirtiną agentą, neleisdamas minties apie jo latentinę būseną. Šiai nuomonei iš pradžių pritarė ir molekulinės genetikos klasikas jo kolegos JAV dirbo su vadinamaisiais T-fagais, kurie nepajėgia integruotis į bakterijų chromosomą Dėl „autoritetų demono“ lizogenija nebuvo skrupulingai tiriama nuo 20-ųjų. puikus mikrobiologas iš Pastero instituto Eugene'as Wolmanas buvo sučiuptas vokiečių kaip Paryžiaus žydas ir mirė.

Po karo Lvovas Pastero institute atnaujino latentinių fagų vežimo tyrimus. 1953 m. jis sukūrė nuoseklią profago koncepciją, iškart suprasdamas jos reikšmę virusinei vėžio teorijai ir daugeliui virusinių žmonių patologijų. Jo aiški lizogenijos reiškinio schema vis dar pateikiama visuose pranešimuose apie molekulinę genetiką.

1958 m. F. Jacobas ir Elias Wolmanas (Eugene'o Wolmano sūnus) įvedė terminą „epizomas“ elementams, kurie gali egzistuoti arba laisvoje būsenoje, arba integruoti į šeimininko genomą. Jie apėmė vidutinio klimato fagus, bakterijų lytinį faktorių ir kolicinogeniškumo faktorius, kurių pagalba kai kurios bakterijų padermės naikina kitas bakterijas, kaip episomas. Įspūdingoje knygoje „Bakterijų seksas ir genetika“, parašytoje 1961 m. (ir kitais metais išleistoje garsaus genetiko S. I. Alikhanyano pastangomis rusų kalba), autoriai gudriai numatė, kad aukštesniuosiuose organizmuose egzistuoja į epizodą panašūs elementai. 50-ųjų pradžioje B. McClintockas atrado „kontroliuojančius elementus“ (1983 m. Nobelio fiziologijos arba medicinos premija). Tačiau tuo metu jie nesuprato, kokia gili yra ši analogija. 70-ųjų pradžioje atradus įterpimo mutacijas, kurias sukėlė virusinės DNR įtraukimas į bakterijų ląstelių genomą, tapo įmanoma sukurti evoliucinę dvikrypčių perėjimų seriją: įterpimo segmentus, transpozonus, plazmides, fagus.

Panašios transformacijų serijos buvo aptiktos eukariotuose. Drosofiloje mobilūs čigonų („čigonų“) šeimos elementai gali egzistuoti kopijų, įmontuotų į chromosomą, pavidalu; citoplazmoje turi būti pilnų arba sumažintų žiedinių arba linijinių plazmidžių pavidalu; galiausiai, atskirų „leidžiamųjų“ mutacijų šeimininko genome atveju jie gali apsivilkti apvalkalu, tapti tikrais infekciniais retrovirusais ir per maistą užkrėsti svetimus šeimininkus. P-transposonų panašumas Drosophila ir endogeninio retroviruso ŽIV žmonėms (lentelė) leidžia numatyti galimus evoliucinius genetinius įvykius žmonių populiacijose, neišvengiamų dabar ir būsimų kontaktų su užsienio genomais likimą.

Fakultatyvumo principas ir apibendrinta genomo samprata

Daugelis kintamumo faktų, susijusių su perkeliamais elementais, netelpa į mutacijų, kaip lokalizuotų genų lokusų struktūros, skaičiaus ar vietos pokyčių, sampratą. Siekdamas sujungti klasikinės ir „mobiliosios“ genetikos duomenis, 1985 metais pasiūliau natūralią genomo elementų klasifikaciją, apimančią dvi posistemes: privalomuosius (genai ir jų reguliavimo sritys chromosomose) ir fakultatyvinius elementus (DNR ir RNR nešėjai, skaičius). ir kurių topografija skiriasi skirtingose ​​tos pačios rūšies ląstelėse arba organizmuose).

Iš šios klasifikacijos išplaukia svarbios pasekmės, leidžiančios suprasti arba suformuluoti daug neįprastų faktų paveldimo kintamumo srityje. Įvardinkime kai kuriuos iš jų:

• pasirenkamumo universalumas. Nėra rūšių genomų, susidedančių tik iš privalomų elementų, kaip ir nėra gyvų organizmų, susidedančių tik iš skeleto skeleto;
• dukterinių ląstelių genetinė netapatybė. Dėl atsitiktinumo jie skiriasi citoplazminių fakultatyvinių elementų skaičiumi ir sudėtimi. Privalomųjų ir fakultatyvinių DNR elementų frakcijų santykis yra gana stabilus rūšies požymis. Turėdamos panašų genų lokusų skaičių, artimai giminingos rūšys DNR kiekiu gali skirtis 2-5 ir daugiau kartų, padidindamos pasikartojimų blokus ir keisdamos jų genominę topografiją. Nuolat stebimi įvairūs perėjimai tarp privalomosios ir fakultatyvinės genomo dalių. Ryškiausi pavyzdžiai – genų mutacijos dėl perkeliamų elementų įvedimo (įterpimų) arba chromosomų segmentų skaičiaus padauginimo (amplifikacijos) ir jų perėjimo į skirtingas vidines ir ekstrachromosomines būsenas;
• būdingas kiekvienos iš dviejų genomo posistemių paveldimų variacijų tipas. Morganų mutacijos lengvai koreliuojamos su privalomuoju komponentu. Įvairius paveldimus pasirenkamų elementų skaičiaus ir topografijos pokyčius pasiūliau vadinti „variacijomis“ (kaip muzikoje - variacijos tam tikra tema). Mutacijos, remiantis klasikinėmis sąvokomis, paprastai įvyksta atsitiktinai, mažu dažniu atskiriems asmenims. Variacijų pobūdis visiškai kitoks – čia galimi masiniai, tvarkingi pokyčiai, veikiami įvairių veiksnių, įskaitant silpnus nemutageninius veiksnius (temperatūra, mityba ir kt.);
• daugelio natūralių paveldimų pokyčių dviejų etapų pobūdis. Pirma, fakultatyviniai elementai aktyvuojami kaip jautriausi aplinkos pokyčiams. Tada genų lokusai pradedami netiesiogiai paveikti. Prie tokios išvados priėjome daug metų stebėję mutacijų protrūkius gamtoje. Dauguma jų pasirodė esantys nestabilūs ir atsirado dėl perkeliamų elementų, kurie retkarčiais paslaptingai suaktyvėja gamtoje, įterpimų. Drosofiloje apie 70% mutacijų, kurios atsiranda spontaniškai gamtoje ar laboratorijoje, yra susijusios su judrių elementų judėjimu.

McClintockas pirmasis padarė išvadą, kad fakultatyvinių elementų suaktyvėjimas ir vėlesnis struktūrinis genomo pertvarkymas gali būti ląstelės adaptacinio atsako į stresą pasekmė. Paveldima sistema, aktyvindama fakultatyvinius elementus, atlieka genetinę paiešką, pereidama į naują adaptacinį funkcionavimo lygį. Taigi, ilgalaikiai L. Z. Kaidanovo tyrimai parodė, kad po ilgalaikio giminystės Drosophila linijose staiga įvyksta daugybiniai judrių genų judesiai ir vietos specifiniai chromosomų persitvarkymai; tuo pačiu metu išgyvenamumas smarkiai padidėja.

Apibendrinta genomo, kaip privalomų ir fakultatyvinių elementų ansamblio, idėja taip pat išplečia „horizontalaus perdavimo“ sąvoką, apimančią ne tik svetimų genų integravimą į branduolines chromosomas. Apie horizontalų perkėlimą jau galime kalbėti tais atvejais, kai sukuriama stabili dviejų genetinių sistemų asociacija, kurioje atsiranda naujų savybių ir savybių.

Funkcinis genomo fakultatyvumas

Paveldimi pokyčiai atsiranda dėl procesų, kurie veikia su bet kokių gyvų organizmų paveldima medžiaga, klaidų - replikacija, transkripcija, vertimas, taip pat taisymas ir rekombinacija.

Fakultatyvinė replikacija reiškia santykinai autonominio atskirų DNR sekcijų hiper- arba hiporeplikacijos galimybę, neatsižvelgiant į planuojamą reguliarų visos genominės DNR replikaciją ląstelių dalijimosi metu. Šias savybes turi chromosomų sekcijos su pasikartojimais, heterochromatino blokais. Šiuo atveju autonominė replikacija padidina atskirų segmentų skaičių ir, kaip taisyklė, turi prisitaikantį pobūdį.

Transkripcijos fakultatyvumas apima galimybę atsirasti skirtingoms mRNR iš to paties šablono dėl to, kad tam tikrame lokuse yra daugiau nei vienas promotorius ir alternatyvus sujungimas. Ši situacija yra įprasta daugeliui genų.

Dviprasmiškumas (S.G. Inge-Vechtomovo terminologija) išreiškiamas skirtingais to paties kodono atpažinimo variantais, pavyzdžiui, stopkodonu arba kodonu, skirtu tam tikros aminorūgšties įtraukimui į sintezuojamą baltymą. Toks vertimas priklauso nuo fiziologinių sąlygų ląstelėje ir nuo genotipo.

Remiantis M. E. Lobaševo mutacijos proceso teorija, mutacijos atsiradimas yra susijęs su ląstelės ir jos paveldimų struktūrų gebėjimu ištaisyti žalą. Iš to išplaukia, kad prieš mutacijos atsiradimą atsiranda būsena, kai pažeidimas yra arba visiškai grįžtamas, arba gali būti realizuotas mutacijos forma, suprantama kaip „ne identiškas atstatymas“. Aštuntojo dešimtmečio pradžioje tapo aišku, kad DNR stabilumas ląstelėje nėra imanentinė pačių DNR molekulių savybė – jį palaiko speciali fermentų sistema.

Nuo aštuntojo dešimtmečio vidurio evoliucinis „rekombinacijos klaidų“ vaidmuo, kaip paveldimų pokyčių, daug galingesnis už DNR replikacijos klaidas, induktorius, pradėjo aiškėti.

Molekuliniu lygmeniu išskiriami trys rekombinacijos tipai: bendroji, specifinė vietai ir replikacinė. Pirmosios, bendros, reguliarios rekombinacijos (perėjimo) atveju taisymas apima DNR grandinės pertraukas, jų kryžminį susiejimą ir atkūrimą. Tam reikia ilgų DNR homologijos sričių. Konkrečios vietos rekombinacija yra turinys su trumpomis, keliomis bazėmis, homologijos sritimis, tokiomis kaip, pavyzdžiui, fago 1 DNR ir bakterijos chromosoma. Panašiai vyksta mobiliųjų elementų įtraukimas į genomą ir somatinė vietinė rekombinacija ontogenezėje tarp imunoglobulino genų, sukuriant nuostabią jų įvairovę.

Bendrosios rekombinacijos klaidos gali būti laikomos natūraliomis linijiškai išplėstos genų struktūros pasekmėmis. Iškyla dilema, apie kurią rašė Khesinas: galime manyti, kad mitozinės rekombinacijos yra ypatinga mutagenezės rūšis arba, priešingai, kai kurios mutacijų rūšys (chromosomų aberacijos) yra mitozinių rekombinacijų „klaidų“ pasekmė.

Jei perkeliamų elementų judėjimas ar regionų rekombinacija yra užprogramuoti ontogenezėje, sunku klasifikuoti tokius paveldimus pokyčius. Lyties transformacija mielėse ilgą laiką buvo laikoma mutaciniu įvykiu, tačiau paaiškėjo, kad tam tikrame askosporos vystymosi etape ji įvyksta su didele tikimybe dėl vietos specifinės rekombinacijos.

Genomo variacijos reaguojant į aplinkos iššūkius

Evoliucijos teorijoje ir genetikoje visada buvo svarstomas paveldimų pokyčių ir atrankos krypties ryšio klausimas. Pagal darvinistines ir postdarvinines idėjas, paveldimi pokyčiai vyksta įvairiomis kryptimis ir tik tada paimami atrankos būdu. Replikos metodas, kurį šeštojo dešimtmečio pradžioje išrado Lederbergų pora, pasirodė ypač vaizdingas ir įtikinamas. Naudodami aksominę medžiagą, jie gavo tikslias eksperimentinio bakterijų inokuliavimo Petri lėkštelėje kopijas – pirštų atspaudus. Tada vienoje iš plokštelių buvo atlikta atranka dėl atsparumo fagui ir palyginta atsparių bakterijų atsiradimo taškų topografija lėkštelėje su fagu ir kontrolėje. Fagams atsparių kolonijų vieta buvo identiška dviejuose kopijų lėkšteliuose. Toks pat rezultatas buvo gautas analizuojant teigiamas bet kurio metabolito defektų turinčias bakterijų mutacijas.

Mobiliosios genetikos srities atradimai parodė, kad ląstelė, kaip vientisa sistema, atrankos metu gali adaptyviai pertvarkyti savo genomą. Ji geba reaguoti į aplinkos iššūkį aktyvia genetine paieška, o ne pasyviai laukti, kol atsitiktinai įvyks mutacija, leidžianti išgyventi. O Lederbergų sutuoktinių eksperimentuose ląstelės neturėjo pasirinkimo: arba mirtis, arba adaptacinė mutacija.

Tais atvejais, kai atrankos faktorius nėra mirtinas, galimi laipsniški genomo pertvarkymai, tiesiogiai ar netiesiogiai susiję su atrankos sąlygomis. Tai tapo aišku, kai 70-ųjų pabaigoje buvo atrastas laipsniškas lokusų, kuriuose yra atsparumo selektyviam agentui, kuris blokuoja ląstelių dalijimąsi, skaičius. Yra žinoma, kad metotreksatas, ląstelių dalijimosi inhibitorius, plačiai naudojamas medicinoje, siekiant sustabdyti piktybinių ląstelių augimą. Šis ląstelių nuodas inaktyvuoja fermentą dihidrofolato reduktazę (DHFR), kurio veikimą kontroliuoja specifinis genas.

Leishmania ląstelių atsparumas citostatiniams nuodams (metotreksatui) didėjo laipsniškai, o amplifikuotų segmentų su atsparumo genu dalis proporcingai didėjo. Buvo padaugintas ne tik pasirenkamas genas, bet ir didelės greta jo esančios DNR dalys, vadinamos amplikonais. Kai Leishmania nuodų atsparumas padidėjo 1000 kartų, amplifikuoti ekstrachromosominiai segmentai sudarė iki 10% ląstelės DNR! Galima sakyti, kad iš vieno privalomo geno susidarė fakultatyvinių elementų telkinys. Atrankos metu įvyko adaptyvi genomo restruktūrizacija.

Jei atranka tęsėsi pakankamai ilgai, kai kurie amplikonai buvo integruoti į pradinę chromosomą, o atrankai pasibaigus, padidėjęs atsparumas buvo nuolat palaikomas.

Pašalinus selektyvųjį agentą iš aplinkos, amplikonų su atsparumo genu skaičius palaipsniui mažėjo per kelias kartas ir kartu mažėjo atsparumas. Taip buvo sumodeliuotas ilgalaikių modifikacijų reiškinys, kai masiniai aplinkos sukelti pokyčiai yra paveldimi, tačiau palaipsniui išnyksta per kelias kartas.

Pakartotinės atrankos metu kai kurie citoplazmoje išsaugoti amplikonai užtikrino greitą autonominę replikaciją, atsparumas atsirado daug greičiau nei eksperimentų pradžioje. Kitaip tariant, išsaugotų amplikonų pagrindu buvo suformuota unikali praeities atrankos ląstelių amplikono atmintis.

Jei palygintume replikos metodą ir atrankos į atsparumą eigą amplifikacijos atveju, paaiškėtų, kad būtent kontaktas su selektyviniu veiksniu lėmė genomo transformaciją, kurios pobūdis koreliavo su atrankos intensyvumu ir kryptimi. .

Diskusija apie adaptacines mutacijas

1988 metais žurnale „Nature“ pasirodė J. Cairnso ir bendraautorių straipsnis apie nuo atrankos priklausančių „kryptinių mutacijų“ atsiradimą bakterijoje E. coli. Mes paėmėme bakterijas, kurios turėjo laktozės operono lacZ geno mutacijas ir negalėjo suskaidyti disacharido laktozės. Tačiau šie mutantai galėjo dalytis terpėje su gliukoze, iš kurios po vienos ar dviejų dienų augimo jie buvo perkelti į selektyvią terpę su laktoze. Pasirinkus lac+ reversus, kurie, kaip ir tikėtasi, atsirado „gliukozės“ dalijimosi metu, neaugančios ląstelės liko angliavandenių bado sąlygomis. Iš pradžių mutantai mirė. Tačiau po savaitės ar ilgiau buvo pastebėtas naujas augimas dėl lacZ geno reversijų protrūkio. Atrodė, tarsi ląstelės stipraus streso sąlygomis nesidalindamos (!) atliktų genetinę paiešką ir adaptyviai keistų savo genomą.

Tolesniame B. Hallo darbe buvo panaudotos triptofano panaudojimo geno (trp) mutantas. Jie buvo dedami ant terpės, kurioje nebuvo triptofano, ir buvo įvertintas grįžimo į normalų dažnis, kuris padidėjo būtent triptofano bado metu. Tačiau šio reiškinio priežastis nebuvo pačios bado sąlygos, nes terpėje su cisteino badu grįžimo į trp+ dažnis nesiskyrė nuo normos.

Kitoje eksperimentų serijoje Hall paėmė dvigubus triptofano trūkumo mutantus, turinčius tiek trpA, tiek trpB genų mutacijas, ir vėl padėjo bakterijas ant terpės, kurioje nėra triptofano. Išgyventi galėjo tik tie asmenys, kurių reversijos įvyko vienu metu dviejuose triptofano genuose. Tokių individų atsiradimo dažnis buvo 100 milijonų kartų didesnis nei tikėtasi dėl paprasto tikimybinio dviejų genų mutacijų sutapimo. Hall mieliau pavadino šį reiškinį „adaptyviosiomis mutacijomis“ ir vėliau parodė, kad jų pasitaiko ir mielėse, t.y. eukariotuose.

Kernso ir Hallo publikacijos iš karto sukėlė karštas diskusijas. Pirmojo jo turo rezultatas – vieno iš pirmaujančių mobiliosios genetikos srities mokslininko J. Shapiro pristatymas. Jis trumpai aptarė dvi pagrindines idėjas. Pirma, ląstelėje yra biocheminių kompleksų arba „natūralių genų inžinerijos“ sistemų, kurios gali atkurti genomą. Šių kompleksų, kaip ir bet kurios ląstelės funkcijos, aktyvumas gali smarkiai keistis priklausomai nuo ląstelės fiziologijos. Antra, paveldimų pokyčių pasireiškimo dažnis visada vertinamas ne vienai ląstelei, o ląstelių populiacijai, kurioje ląstelės gali keistis paveldima informacija. Be to, streso sąlygomis padidėja tarpląstelinis horizontalus virusų perdavimas arba DNR segmentų perkėlimas. Pasak Shapiro, šie du mechanizmai paaiškina adaptyviųjų mutacijų reiškinį ir grąžina jį į įprastinės molekulinės genetikos pagrindą. Kokie, jo nuomone, diskusijos rezultatai? „Mes ten radome genų inžinierių, turintį įspūdingą sudėtingų molekulinių įrankių rinkinį, skirtą DNR molekulei pertvarkyti. .

Pastarieji dešimtmečiai atskleidė nenumatytą sudėtingumo ir koordinavimo sferą ląstelių lygmenyje, kuri labiau suderinama su kompiuterinėmis technologijomis, o ne su mechanizuotu požiūriu, kuris dominavo kuriant neodarvinizmo šiuolaikinę sintezę. Po Shapiro yra mažiausiai keturios atradimų grupės, kurios pakeitė supratimą apie ląstelių biologinius procesus.

Genomo organizacija. Eukariotuose genetiniai lokusai yra išdėstyti pagal modulinį principą, atspindintys visam genomui bendrų reguliavimo ir kodavimo modulių struktūras. Tai užtikrina greitą naujų konstrukcijų surinkimą ir genų ansamblių reguliavimą. Lokusai yra suskirstyti į hierarchinius tinklus, kuriems vadovauja pagrindinis jungiklio genas (kaip lyties reguliavimo ar akių vystymosi atveju). Be to, daugelis pavaldžių genų yra integruoti į skirtingus tinklus: jie veikia skirtingais vystymosi laikotarpiais ir daro įtaką daugeliui fenotipinių bruožų.

Ląstelės reparacinės galimybės. Ląstelės visai nėra pasyvios atsitiktinių fizikinių ir cheminių poveikių aukos, nes jos turi atkūrimo sistemą replikacijos, transkripcijos ir vertimo lygiu.

Mobilieji genetiniai elementai ir natūrali genų inžinerija. Imuninės sistemos darbas grindžiamas nuolatiniu naujų imunoglobulino molekulių variantų konstravimu, remiantis natūralių biotechnologinių sistemų (fermentų: nukleazės, ligazės, atvirkštinės transkriptazės, polimerazės ir kt.) veikimu. Tos pačios sistemos naudoja mobiliuosius elementus naujoms paveldimoms struktūroms kurti. Tuo pačiu metu genetiniai pokyčiai gali būti didžiuliai ir užsakyti. Genomo pertvarkymas yra vienas pagrindinių biologinių procesų. Natūralios genetiškai modifikuotos sistemos yra reguliuojamos grįžtamojo ryšio sistemomis. Kol kas jie lieka neaktyvios būsenos, tačiau pagrindiniais laikotarpiais ar streso metu jie pradeda veikti.

Korinio ryšio informacijos apdorojimas. Galbūt vienas iš svarbiausių atradimų ląstelių biologijoje yra tai, kad ląstelė nuolat renka ir analizuoja informaciją apie savo vidinę būseną ir išorinę aplinką, kad galėtų priimti sprendimus dėl augimo, judėjimo ir diferenciacijos. Ypač orientaciniai yra ląstelių dalijimosi kontrolės mechanizmai, kuriais grindžiamas augimas ir vystymasis. Mitozės procesas yra universalus aukštesniuosiuose organizmuose ir apima tris vienas po kito einančius etapus: pasirengimą dalytis, chromosomų replikaciją ir ląstelių dalijimosi užbaigimą. Šių fazių genų kontrolės analizė leido aptikti specialius taškus, kuriuose ląstelė patikrina, ar ankstesniame etape įvyko DNR struktūros pažeidimų taisymas, ar ne. Jei klaidos nebus ištaisytos, kitas etapas neprasidės. Kai žalos pašalinti nepavyksta, paleidžiama genetiškai užprogramuota ląstelių mirties arba apoptozės sistema.

Aplinkos iššūkių sąlygomis ląstelė veikia tikslingai, kaip kompiuteris, kai jam įsijungus žingsnis po žingsnio tikrinamas normalus pagrindinių programų veikimas, o atsiradus gedimui kompiuterio darbas sustoja. Apskritai, jau ląstelių lygmenyje tampa akivaizdu, kad netradicinis prancūzų evoliucinis zoologas Paulas Grassetas yra teisus: „Gyventi reiškia reaguoti, o ne būti auka“.

Natūralių paveldimų aplinkos pokyčių atsiradimo būdai – fakultatyviniai elementai – privalomųjų elementų sistema. Fakultatyviniai elementai yra pirmieji, kurie suvokia nemutageninius aplinkos veiksnius, o tada atsirandantys variantai sukelia mutacijas. Fakultatyvinių elementų elgesiui įtakos turi ir privalomi elementai.

Nekanoniniai paveldimi pokyčiai, atsirandantys dėl citostatikų atrankos ir sukeliantys genų amplifikaciją.

Įgytos savybės yra paveldimos

„Biologijos istorija nežino raiškesnio šimtmečius trukusios problemos diskusijos pavyzdžio nei diskusija apie įgytų savybių paveldėjimą ar nepaveldėjimą.- šie žodžiai skamba garsaus citologo ir biologijos istoriko L.Ya.Blyakher knygos pradžioje. Galbūt istorijoje galime prisiminti panašią situaciją su bandymais transformuoti cheminius elementus. Alchemikai tikėjo šia galimybe, tačiau chemijoje buvo įtvirtintas postulatas apie cheminių elementų nekintamumą. Tačiau šiais laikais branduolinėje fizikoje ir chemijoje elementų transformacijos tyrimai ir jų evoliucijos analizė yra įprastas dalykas. Kas pasirodė teisus šimtmečius trukusiame ginče? Galima sakyti, kad cheminės molekulinės sąveikos lygmenyje elementų transformacijos nevyksta, tačiau branduoliniame lygmenyje tai yra taisyklė.

Panaši analogija kyla su ontogenezės metu atsiradusių savybių paveldėjimo klausimu. Jei naujai atsirandantys paveldimi pokyčiai redukuojami tik iki genų ir chromosomų mutacijų, tai klausimas gali būti laikomas uždaru. Bet jei mes einame iš apibendrintos genomo sampratos, įskaitant dinaminio paveldimumo idėją [, ], problemą reikia peržiūrėti. Be mutacijos, yra paveldimo kintamumo variacinės ir epigenetinės formos, susijusios ne su DNR teksto, o su geno būsenos pokyčiais. Tokie padariniai yra grįžtami ir paveldimi.

Įdomu tai, kad Tarptautinis genetikos metraštis, išleistas 1991 m. pabaigoje, pradedamas O. Landmano straipsniu „Įgytų savybių paveldėjimas“. Autorius apibendrina seniai genetikoje gautus faktus, parodydamas tai „Įgytų savybių paveldėjimas yra visiškai suderinamas su šiuolaikine molekulinės genetikos samprata. Landmanas detaliai išnagrinėja apie dešimt eksperimentinių sistemų, kuriose nustatytas įgytų savybių paveldėjimas. Ją gali sukelti keturi skirtingi mechanizmai: ląstelės membranos, arba žievės, struktūrų pokyčiai, kuriuos tyrė T. Sonneborn blakstienas; DNR modifikacijos, t.y. kloniškai perduodami vietinio DNR metilinimo pobūdžio pokyčiai (tai apima įspaudimo reiškinį); epigenetiniai pokyčiai be jokių DNR modifikacijų; sukeltas neprivalomų elementų praradimas arba įsigijimas.

Landmano straipsnis verčia mus tarsi tapti kritinio genetikos postulato, kuris atrodė nepajudinamas kaip uola, pokyčių laikotarpio liudininkais. Autorius ramiai, be jaudulio ar naujų stulbinančių faktų sujungia senus ir naujus duomenis į sistemą, suteikdamas jiems aiškią šiuolaikišką interpretaciją. Galima suformuluoti bendrą principą: įgytų savybių paveldėjimas galimas tais atvejais, kai tam tikras fenotipinis požymis priklauso nuo fakultatyvinių elementų skaičiaus ar topografijos.

Pateiksiu du pamokančius pavyzdžius apie Drosophila: pirmasis yra susijęs su sigmos viruso elgesiu, antrasis - su mobiliaisiais elementais, atsakingais už hibridinį patelių sterilumą ir supermutaciją.

Sigmos viruso sąveikos su Drosophila genomu tyrimas pradėtas daugiau nei prieš 60 metų. Pirma, 1937 m. prancūzų genetikas F. Léritier aptiko ryškius paveldimus skirtingų musių linijų jautrumo anglies dioksidui (CO 2 ) laipsnio skirtumus. Požymis buvo paveldėtas keistu būdu: per citoplazmą, bet ne tik per motinos liniją, o kartais ir per patinus. Jautrumas taip pat gali būti perkeltas suleidus hemolimfą į įvairių tipų Drosophila. Šiais atvejais požymis nebuvo perduotas stabiliai, tačiau dėl atrankos paveldėjimas tapo stabilus.

Drosophila bruožo, kuris priklauso nuo fakultatyvinių genominių elementų populiacijos, paveldėjimas ne Mendelio. Jautrumo CO 2 požymį sukelia musės citoplazmoje esantis rabdoviruso sigma. Dėl temperatūros šoko ankstyvoje Drosophila vystymosi stadijoje viruso dauginimasis blokuojamas, o suaugę individai įgyja jam atsparumą.

Jautrumas CO 2 buvo susijęs su stabiliu RNR turinčios kulkos formos rabdoviruso sigmos dauginimu gemalinėse ir somatinėse ląstelėse, kurios daugeliu savybių yra panašios į žinduolių pasiutligės virusą. Oogonijos (ląstelės, iš kurių susidaro kiaušinėliai mejozės ir brendimo metu) stabilizuotos linijos patelėse paprastai turi 10-40 viruso dalelių, o oocituose (subrendusiose kiaušinėliuose) – 1-10 mln. Sigmos virusas yra tipiškas fakultatyvinis elementas. Jos genomo mutacijos sukelia sudėtingas sistemos elgesio formas. Nustatyti viruso pernešimo atvejai, kai Drosophila išlieka atspari CO 2, bet tuo pat metu yra atspari kitų viruso padermių infekcijai. Situacija gana panaši į fagų-bakterijų sistemos elgesį, kurį iškart pastebėjo F. Jacobas ir E. Wolmanas.

Ryšys tarp Drosophila genomo ir jo citoplazmoje besidauginančio viruso paklūsta tarpląstelinės genetikos taisyklėms. Poveikis ontogenezės metu gali sukelti dalelių skaičiaus ir tarpląstelinės topografijos pasikeitimą ir dėl to pakeisti jautrumo anglies dioksidui laipsnį. Taigi, pakilusi temperatūra blokuoja viruso dalelių dauginimąsi. Jei gametogenezės metu patelės ir patinai keletą dienų bus laikomi 30°C temperatūroje, tokių musių palikuonys bus neužkrėsti virusu ir atsparūs CO 2. Tai reiškia, kad individualaus vystymosi metu įgytas bruožas yra paveldimas per keletą kartų.

Situacija su sigma virusu nėra išskirtinė. Prancūzų genetikai tyrė moterų nevaisingumo veiksnius, susijusius su „I“ tipo mobiliųjų elementų elgesiu. Šio požymio paveldėjimą lemia sudėtingos branduolio ir citoplazmos sąveikos. Jei aktyvūs I elementai yra lokalizuoti tėvo chromosomose, tada R-citoplazmos fone jie pradeda aktyvuotis, daug kartų perkeliami ir dėl to sukelia rimtus ontogenetinius sutrikimus patelių, turinčių jautrią citoplazmą, palikuonims. Tokios patelės deda kiaušinėlius, tačiau dalis embrionų miršta ankstyvoje skilimo stadijoje – dar prieš susiformuojant blastomerui. Iš natūralių populiacijų išskirtos linijos skiriasi I faktorių veikimo stiprumu ir citoplazmos reaktyvumo (arba jautrumo) laipsniu. Šiuos rodiklius gali pakeisti išorinė įtaka. Pirminių tėvų patelių amžius, taip pat padidėjusi temperatūra ankstyvuoju vystymosi laikotarpiu, turi įtakos ne tik suaugusių patelių, bet ir jų palikuonių vaisingumui. Aplinkos sąlygų sukelti citoplazminio reaktyvumo pokyčiai išlieka per daugelį ląstelių kartų. „Įspūdingiausias dalykas yra tai, kad šie citoplazmos reaktyvumo pokyčiai, veikiami ne genetinių veiksnių, yra paveldimi: stebimas „įgytų“ savybių paveldėjimas.- pažymėjo R.B. Khesinas.

Paveldėjimas per citoplazmą: nuo močiučių iki anūkų

XX amžiaus raidos ir fenogenetikos teorijoje. Svarbią vietą užima gilūs ir visiškai originalūs embriologo P. G. Svetlovo (1892–1972) tyrimai. Apsistokime prie jo sukurtos ontogenezės kvantavimo teorijos (kritinių vystymosi laikotarpių buvimas, kai įvyksta morfogenetinių procesų determinacija ir tuo pačiu didėja ląstelių jautrumas žalingiems veiksniams) ir 2010 m. tai susiję su tuo, kad ontogenezės tyrimas neturėtų būti atliekamas nuo apvaisinimo ir zigotos susidarymo momento, taip pat nuo gametogenezės, įskaitant ankstesnės kartos patelių oogenezę - proembrioninį laikotarpį.

Remdamasis šiais postulatais, Svetlovas septintajame dešimtmetyje atliko paprastus ir aiškius eksperimentus su Drosophila ir pelėmis. Jis įtikinamai parodė, kad galimas nuolatinis nemendelio citoplazminių savybių paveldėjimas, o mutantinių požymių raiškos modifikacijos, atsiradusios po trumpalaikio išorinio poveikio kritiniu organizmo vystymosi laikotarpiu, taip pat perduodamos per keletą kartų.

Viename iš eksperimentų serijų jis palygino mutantinio požymio pasireiškimo laipsnį dviejų linijų, heterozigotinių pelių palikuonims dėl recesyvinės mikroftalmijos mutacijos (sumažėjęs tinklainės ir akių dydis nuo gimimo momento): heterozigotai normalūs. fenotipu, kurių motinos buvo mutantės, ir tų, kurių tėvai mutantai. Močiutės mutantės palikuonys išsiskyrė stipresniu bruožo pasireiškimu. Svetlovas šį keistą faktą paaiškino tuo, kad heterozigotinių patelių moteriškos lytinės ląstelės vis dar buvo jų motinų mutantų organizme ir buvo jų paveiktos, o tai padidino jų anūkų mutacijas.

Iš esmės Svetlovas nustatė reiškinį, kuris vėliau tapo žinomas kaip „genominis įspaudas“ – geno raiškos skirtumą priklausomai nuo to, ar palikuonis atkeliavo iš motinos, ar iš tėvo. Šie darbai, deja, liko neįvertinti.

Įdomu tai, kad dar devintojo dešimtmečio pabaigoje imprinting, kaip šmaikščiai pastebėjo šio reiškinio tyrinėtojas K. Sapienza. „Paprastai tai laikoma genetiniu smalsumu, turinčiu įtakos tik labai nedaugeliui bruožų. Manęs ne kartą klausė, kodėl aš tiesiog švaistau savo laiką tokiam nereikšmingam reiškiniui.. Dauguma tyrinėtojų besąlygiškai pritarė vienai iš pagrindinių Mendelio nuostatų – „gemalas“ arba genas negali keisti savo stiprumo priklausomai nuo lyties, kuria grindžiamas dažniausiai stebimas 3:1 padalijimas. Tačiau Sapienza visiškai teisingai pažymėjo, kad analizuodami Mendelio segregaciją jie dažniausiai atsižvelgia tik į bruožo buvimą ar nebuvimą, o jei jis yra kiekybinis, tada į ribą. taip ar ne nustatyta pagal priimtą slenkstį. Jei nustatysime požymio pasireiškimo laipsnį, atsiskleis genomo įspaudo įtaka.

Būtent toks buvo Svetlovo požiūris, kai jis atidžiai tyrinėjo, kaip keičiasi palikuonių bruožų raiška priklausomai nuo motinos genotipo. Būdamas embriologu, jis įžvelgė paveldimų ir ypatingų nepaveldimų pokyčių – fenokopijų (modeliuojančių mutacijas) – bendrumą, jei paveikiamas tas pats morfogenetinis aparatas, atsakingas už tam tikros savybės įgyvendinimą.

Pirmą kartą, naudodamas skirtingas gyvūnų rūšis (drozofilą ir peles), Svetlovas parodė galimybę paveldėti per mutantinio geno pasireiškimo pakitusio pobūdžio mejozę. Khesinas ne veltui šiuos kūrinius savo santraukoje pavadino nuostabiais.

Trumpalaikis (20 min.) aštuonių dienų pelių patelės kūno kaitinimas sukėlė nuolatinius kiaušialąsčių pokyčius, susilpnindamas žalingos mutacijos poveikį anūkams! "Akių vystymosi pagerėjimo perkėlimas, pastebėtas atliekant eksperimentus su šildymu, gali būti paaiškintas tik savybių, įgytų paveldėjimo būdu, perkėlimu šildomų patelių oocituose.". Svetlovas šį reiškinį siejo su gyvūnų kiaušinėlio formavimosi ir struktūros ypatumais, nes „Oocite yra tarsi rėmas, atspindintis bendriausius statomo organizmo architektonikos bruožus“. Kad būtų išvengta žmonių vystymosi sutrikimų, jis pagrindė būtinybę ištirti kritinius gametogenezės laikotarpius, kai padidėja jautrumas pažeidimams. Galbūt žmogaus vystymosi anomalijų patogenezėje gametų formavimosi stadija yra net svarbesnė nei embriogenezė.

P.G. Svetlovo eksperimentų schema, rodanti mutacijos mikroftalmijos perdavimą kelioms pelių kartoms. Vieną kartą 20 minučių veikiant aukštai temperatūrai aštuonių dienų mutantėms pelėms pagerėjo jų palikuonių akių vystymasis (F1 ir F2). Ši savybė paveldima tik per motinos liniją ir yra susijusi su kiaušialąsčių pokyčiais.

Šiandien šią išvadą patvirtina pastarojo dešimtmečio molekuliniai genetiniai tyrimai. Drosophila turi tris motininių genų sistemas, kurios sudaro ašinį ir polinį citoplazmos heterogeniškumą ir biologiškai aktyvių genų produktų pasiskirstymo gradientus. Dar gerokai iki tręšimo pradžios įvyksta molekulinis struktūrinio plano ir pradinių vystymosi etapų nustatymas (predestinacija). Motinos organizmo ląstelių genų produktai vaidina svarbų vaidmenį formuojantis oocitui. Kai kuriais atžvilgiais tai galima palyginti su grupe bičių darbininkių, maitinančių motinėlę avilyje.

Žmonėms pirminės lytinės ląstelės, iš kurių vėliau atsiranda kiaušinėlių lytinės ląstelės, pradeda atsiskirti dviejų mėnesių embrione. Sulaukę 2,5 mėnesio jie patenka į mejozę, tačiau iškart po gimimo šis dalijimasis blokuojamas. Jis atsinaujina po 14-15 metų, prasidėjus brendimui, kai kartą per mėnesį iš folikulų išsiskiria kiaušinėliai. Tačiau antrojo dalijimosi pabaigoje mejozė vėl sustoja ir jos užsikimšimas pašalinamas tik susitikus su sperma. Taigi patelės mejozė prasideda 2,5 mėnesio ir baigiasi tik po 20-30 ar daugiau metų, iškart po apvaisinimo.

Dviejų–aštuonių ląstelių stadijoje esanti zigota susilpnino genomo imunitetą. Tirdami nestabilias intarpines mutacijas natūraliose Drosophila populiacijose, nustatėme, kad perkeliamo elemento aktyvacija, lydima mutacinio perėjimo, dažnai įvyksta jau pirmuosiuose zigotos skyriuose arba pirmuosiuose pirminių lytinių ląstelių dalijimuose. Dėl to vienas mutantinis įvykis iš karto užfiksuoja pirminių lytinių ląstelių kloną, lytinių ląstelių telkinys tampa mozaika, o paveldimi palikuonių pokyčiai vyksta ryšuliuose arba klasteriuose, imituojant šeimos paveldėjimą.

Šie eksperimentai yra labai svarbūs epidemiologijai, kai kyla klausimas apie konkrečios virusinės epidemijos įtakos palikuonių genofondui laipsnį. 60-ųjų pradžioje pradėti novatoriški S. M. Gershenzono ir Yu. N. Aleksandrovo tyrimai leido padaryti išvadą, kad DNR ir RNR virusai bei jų nukleorūgštys yra galingi mutageniniai agentai. Patekę į ląstelę, jie provokuoja genominį stresą, aktyvuoja šeimininko judriųjų elementų sistemą ir sukelia nestabilias įterpimo mutacijas pasirinktų lokusų grupėje, būdingoje kiekvienam agentui.

Dabar įsivaizduokite, kad norime įvertinti virusinės pandemijos (pavyzdžiui, gripo) poveikį žmogaus paveldimumui. Tuo pačiu galima tikėtis, kad pirmoje kartoje padidės įvairių vystymosi anomalijų dažnis palikuonims, gimusiems metais ar metais po epidemijos. Anūkų kartoje turėtų būti atliktas lytinių ląstelių (gametų) mutacijų ir variacijos pokyčių dažnio įvertinimas.

Trijų iš eilės moterų kartų oogenezės schema. P – močiutė, F1 – mama, F2 – dukra.

Bendra išvada yra tokia, kad anūkų genetinė variacija gali labai priklausyti nuo sąlygų, kuriomis jų močiutėse įvyko oogenezė! Įsivaizduokime moterį, kuriai 2000-aisiais buvo apie 25-eri, o trečiajame tūkstantmetyje taps mama. Apvaisintas kiaušinėlis, iš kurio ji pati gimė, pradėjo formuotis, kai mama dar buvo dviejų mėnesių embriono, t.y. kažkur XX amžiaus 50-ųjų viduryje. Ir jei per šiuos metus gripas siautėjo, jo pasekmės turėtų pasijusti per vieną kartą. Norint įvertinti pasaulinės epidemijos pasekmes žmonijos genofondui, reikia palyginti trijų grupių anūkus arba kohortas – tuos, kurių močiutės buvo nėščios epidemijos metais, su tais, kurių močiutės pastojo anksčiau. ir po pandemijos (tai dvi kontrolinės grupės). Deja, tokios sveikatos apsaugai svarbios epidemiologinės ir genetinės informacijos kol kas nėra.

Apie vaiduoklius ir kovojančius monstrus

Praėjo 30 metų nuo Svetlovo eksperimentų, kurie buvo paprastos technikos, bet originalios koncepcijos ir gilių išvadų. Dešimtojo dešimtmečio viduryje įvyko psichologinis lūžis: staigiai padaugėjo darbų paveldimo kintamumo srityje, kurių pavadinime yra žodis „epigenetinis“.

Įvairūs epimutacijų tipai (paveldimi genų veiklos pobūdžio kitimai, nesusiję su DNR teksto pokyčiais ir yra masiniai, nukreipti ir grįžtami) iš ribinių kategorijos perėjo į aktyviai tyrinėjamą reiškinį. Tapo akivaizdu, kad gyvosios sistemos turi operacinę „atmintį“, kuri nuolat kontaktuoja su aplinka ir naudoja natūralios embriogenetinės inžinerijos priemones greitam paveldėtam perėjimui iš vieno veikimo režimo į kitą. Gyvos sistemos nėra pasyvios natūralios atrankos aukos, ir visos evoliucinės gyvybės formos nėra pasyvios „dėmė trumpai dingimo dienai“, kaip rašė Mandelstamas savo garsiajame šedevre „Lamarkas“.

Paaiškėjo, kad epimutacijas dažnai galima rasti įprastuose „klasikiniuose genuose“, tereikia pasirinkti tinkamą eksperimentinę sistemą. Dar 1906 m., likus penkeriems metams iki Morgano pradėjimo dirbti su Drosophila, prancūzų evoliucijos biologas L. Cano pelėse atrado Mendelio mutaciją „geltonkūnis“. Jis turėjo nuostabią savybę - dominavimą prieš normalią spalvą (pilkai rudą) ir mirtingumą homozigotoje. Kryžminus heterozigotines geltonąsias peles, dėl homozigotų mirties palikuoniuose atsirado normalių pelių santykiu ne 3:1, o 2:1. Vėliau paaiškėjo, kad daugelis dominuojančių mutacijų skirtinguose organizmuose taip elgiasi.

Paaiškėjo, kad vieno iš „corpus luteum“ geno alelių transkripcijos srityje buvo įvestas mobilusis elementas, savo struktūra ir savybėmis primenantis retrovirusą. Dėl šio įterpimo genas pradėjo paklusti savo įsibrovėlio skyrybos ženklams ir nenuspėjamai suaktyvėjo „Netu laiku ir netinkamoje vietoje“. Mutantams su intarpais atsiranda daug defektų (geltona kailio spalva, nutukimas, diabetas ir kt.), o elgesys tampa nestabilus. Nereikalingas įterpimo aktyvumas skirtingu laipsniu slopinamas skirtinguose audiniuose dėl grįžtamojo DNR bazių modifikavimo arba metilinimo. Fenotipiniame lygmenyje dominuojančio alelio pasireiškimas labai skiriasi ir yra mozaikinio pobūdžio. Australų genetikai išsiaiškino, kad geltonos spalvos patelės, atrinktos iš vienalytės linijos, palikuoniuose turėjo daugiau geltonųjų pelių, o tėvo, mutacijos nešiotojo, fenotipas palikuonių spalvos pasikeitimui įtakos neturi. Patelės pasirodė inertiškesnės ir jos, atrinktos pagal DNR modifikacijos fenotipą arba įspaudus, geriau išsilaikė oogenezėje. Kiti genetikai taip pat nustatė grynai motinišką įtaką, panašią į tą, kuri buvo nustatyta Svetlovo eksperimentuose. Priklausomai nuo nėščių patelių mitybos, heterozigotų genotipo „geltonkūnio“ mutacijos sunkumas tam tikru būdu pasikeitė. Ši pakitusi būsena yra nestabili, bet paveldima palikuonims. Požymio pasireiškimo laipsnis koreliavo su DNR bazių metilinimo laipsniu intarpe.

Remdamasis šiais ir kitais panašiais eksperimentais, žurnalo „Science“ mokslinis apžvalgininkas savo straipsnį pavadino „Ar Lamarckas vis dar buvo šiek tiek teisus? Toks taktiškumas suprantamas. Pirma, reikia būti atsargiems, kai reikia peržiūrėti tai, kas dešimtmečius buvo laikoma tvirtai įsitvirtinusi. Antra, įgytų savybių paveldėjimas siejamas ne tik su Lamarko vardu, bet ir su Lysenkos šmėkla (pastarąją mini užrašo autorius). Iš tiesų, norom nenorom, kalbant apie įgytų savybių paveldėjimo problemą, iškyla „Mičurino biologijos“ šešėlis. Ir ne tik Rusijoje, kur vis dar gyva atmintis apie tragediją biologijoje, susijusią su Lysenkos dominavimu.

Šiandien daugelis visuotinai priimtų klasikinės genetikos nuostatų, kurias Lysenko atmetė, netyčia, nepaisydami jo, tapo beveik absoliučia tiesa. Ir vis dėlto, jei tas ar kitas rimtas tyrinėtojas atrado kažką išoriškai atitinkančio Lysenkos pažiūras, jis bijojo tai viešinti, bijodamas mokslo bendruomenės išstūmimo. Ir net jei kūrinys buvo išleistas, jis buvo lydimas daug išlygų ir liko mokslo periferijoje.

60-aisiais susipažinęs su A. A. Liubiščevo (Svetlovo artimiausio draugo) straipsniais, bandžiau suprasti, kodėl, būdamas vienu aktyviausių samizdatų lysenkoizmo kritikų 1953–1965 m., jo straipsniai ir laiškai buvo surinkti į knygą „In. Mokslo gynimas“ (L., 1990) – vis dėlto įgytų savybių paveldėjimo klausimo nelaikė galutinai išspręstu. Šis visuotinai pripažintas evoliucinės biologijos ekspertas atkreipė dėmesį į paveldimumo teorijos neišsamumą ir paveldimo bei modifikacinio kintamumo panašumą. Dabar žinome, kaip daugeliu atvejų sunku tarp jų nubrėžti ribą. Liubiščevas citavo masinių, greitų ir tvarkingų fenotipo transformacijų evoliucijoje faktus, aiškiai nepaaiškinamus Morgano mutacijų ir Darvino atrankos požiūriu. Pakeldamas balsą prieš Lysenkos monopolį, Liubiščevas pasisakė gindamas mokslą kaip tokį, prieš jame įsitvirtinusį Arakčejevo režimą. Pačioje mokslo srityje jis vadovavosi senoviniu principu: „Platonas yra mano draugas, bet tiesa brangesnė“.

9. McClintock B.// Mokslas. 1984. V.226. P.792-801.

10. Kernsas J.//Gamta. 1988. V.27. P.1-6.

11. D salė.// Genetika. 1990. V.126. P.5-16

12. Šapiro J.// Mokslas. 1995. V.268. P.373-374.

12. Blyakher L. Ya.Įgytų savybių paveldėjimo problema. M., 1971 m.

13. Landmanas O.//Anas. Kunigas Genet. 1991. V.25. P.1-20.

14. Sokolova K.B. Fenogenetikos raida XX amžiaus pirmoje pusėje. M., 1998 m.

15. Sapienza K.// Mokslo pasaulyje. 1990. ?12. P.14-20.

16. Svetlovas P. G.// Genetika. 1966. ?5. P.66-82.

17. Koročkinas L. I.Įvadas į vystymosi genetiką. M., 1999 m.

2011-09-05, 09:36, Limarevas pasakė:

Limarevas V.N.

Žmogaus genomo dekodavimas.

Fragmentas iš L. G. knygos. Puchko: „Radietinis žmogaus pažinimas“

Genomo iššifravimo problemai išspręsti buvo surengtas tarptautinis projektas „žmogaus genomas“, kurio biudžetas siekė milijardus dolerių.

Iki 2000 m. žmogaus genomas buvo praktiškai suplanuotas. Genai buvo suskaičiuoti, identifikuoti ir įrašyti į duomenų bazes. Tai didžiuliai informacijos kiekiai.

Žmogaus genomo įrašymas skaitmenizuota forma užima apie 300 terabaitų kompiuterio atminties, o tai prilygsta 3 tūkstančiams 100 gigabaitų talpos kietųjų diskų.

Tai paaiškėjo. Kad žmogus turi ne šimtus tūkstančių, kaip manyta anksčiau, o kiek daugiau nei 30 tūkstančių genų. Musė turi vaisinių muselių, jų tik perpus mažiau – apie 13 tūkstančių, o pelės – beveik tiek pat, kiek ir žmogus. Iššifruotame genome yra tik apie 1% genų, būdingų tik žmogui. Didžiąją dalį DNR spiralės, kaip paaiškėjo, užima ne genai, o vadinamosios „tuščios sekcijos“, kuriose genai tiesiog nėra užkoduoti, taip pat vienas po kito kartojasi dvigubi fragmentai, prasmė ir prasmė. kas neaišku.

Žodžiu, genai pasirodė net ne gyvybės statybiniai blokai, o tik plano, pagal kurį statomas kūno pastatas, elementai. Statybiniai blokai, kaip paprastai buvo manoma prieš genetikos iškilimą, yra baltymai.

Tapo visiškai akivaizdu, kad 1% genų, būdingų tik žmogui, negali užkoduoti tokio didžiulio informacijos kiekio, kuris skiria žmogų nuo pelės. Kur saugoma visa informacija? Daugeliui mokslininkų tampa nepaneigiamas faktas, kad be dieviškojo principo neįmanoma paaiškinti žmogaus prigimties. Nemažai mokslininkų teigia, kad, remiantis esamomis idėjomis apie žmogaus kūną, žmogaus genomo iššifruoti iš esmės neįmanoma.

Pasaulis nėra žinomas – jis pažįstamas (mano komentarai prie straipsnio).

1) Apsvarstykite fragmentą: „Be dieviškojo principo neįmanoma paaiškinti žmogaus prigimties“.

Aukščiau pateikta informacija jokiu būdu to nerodo.

Genomas iš tikrųjų turi sudėtingesnę struktūrą, nei manyta anksčiau.

Bet juk straipsnyje minimas kompiuteris susideda ne tik iš atminties ląstelių.

Kompiuteris turi dvi atmintis: ilgalaikę ir veikiančią, taip pat procesorių, kuriame apdorojama informacija. Elektromagnetinis laukas taip pat dalyvauja apdorojant informaciją. Norint iššifruoti genomo informaciją, reikia suprasti, kaip ji vyksta, ne tik informacijos saugojimą, bet ir jos apdorojimą. Taip pat pripažįstu mintį, kad dalis informacijos saugoma įrašyta per elektromagnetinį lauką. Ir taip pat už žmogaus ribų, kaip jau rašiau, specialiuose Aukščiausiojo proto informacijos centruose.

Įsivaizduokite ištisinį tekstą, užkoduotą dvejetainiu kodu 0 arba 1 Morzės abėcėlėje, kol nežinote, kokia kalba jis parašytas (anglų ar prancūzų....) ir nežinote, kad šis tęstinis tekstas susideda iš žodžių, sakinių. , pastraipos, skyriai, tomai, lentynos, spintelės ir kt.

Biologijoje beveik tas pats, tik čia viskas užkoduota keturženkliu kodu ir mes iki šiol iššifravome elementariųjų genų tvarką + - / *, bet nemokame kalbos ir atitinkamai žodžiai, sakiniai, pastraipos, skyriai, tomai, lentynos, spintos ir kt. Mums iššifruotas genomas vis dar yra tvirtas 4 laipsnių kodo tekstas ir beveik neįmanoma viso to ištirti.

Bet pasirodo, kad tam tikrais laikotarpiais (tiek individe, tiek jo kartų grupėje, tiek rūšyje, gentyje) kai kurie genai ir jų kompleksai (atsakingi už žodžius, sakinius, pastraipas, skyrius, tomus, lentynas, spinteles ir kt. .) yra aktyvūs , o kitais evoliucijos laikotarpiais yra pasyvūs, kuriuos netiesiogiai nulemiau įvairiomis poligeninėmis savybėmis (kaip parodyta temoje Bendrasis periodinis evoliucijos dėsnis).

Šiuo metu yra tik du metodai genams tirti, tai yra paprastas laboratorinis mėginio genų sumos (DNR) apskaičiavimas ir yra prietaisas, skaičiuojantis pagamintos baltymo RNR kiekį. prilipo prie pagaminto elektroninio lusto specifinės DNR, tačiau kadangi bet kuriuo metu yra aktyvus didžiulis kiekis DNR ir atitinkamai per RNR gaminamas didžiulis kiekis skirtingų baltymų, labai sunku atskirti „šiuos makaronus šaukštu, šakute ir japoniškomis lazdelėmis“. šią sriubą ir raskite tai, ko ieškote – raskite priežasties ir pasekmės ryšius tarp specifinės DNR (kaip DNR komplekso) ir jos įtakos poligeniniam bruožui.

Atrodo, radau paprastą metodą, kaip surūšiuoti visą šią DNR, RNR ir jų baltymų, lemiančių poligeniškumo laipsnį, sriubą.

Kaip paaiškėjo, kiekvienas poligeninis požymis individo evoliucijos tvarka (kartų grupė, rūšis ir gentis) yra periodiškas, todėl jis turi būti periodiškas RNR ir DNR veikloje, todėl tereikia rasti (pirmiausia). einant į genetines detales) koreliacija tarp metrinio poligeninio požymio pokyčio (individui, kartų kohortai, rūšiai, genčiai...) ir atitinkamo RNR, DNR aktyvumo, proporcingo šiems laikotarpiams.

visiškai apibrėžtas. Todėl darbas, skirtas iššifruoti nematodo genomą, turėtų būti laikomas labai sėkmingu.

Dar didesnė sėkmė siejama su Drosophila genomo iššifravimu, tik in

2 kartus mažesnis už žmogaus DNR ir 20 kartų didesnis už nematodo DNR. Nepaisant didelio Drosophila genetinių žinių lygio, iki šios akimirkos apie 10% jos genų buvo nežinomi. Tačiau paradoksaliausia yra tai, kad Drosophila, kuri yra daug labiau organizuota, palyginti su nematodu, turi mažiau genų nei mikroskopinė apvalioji kirmėlė! Iš šiuolaikinių biologinių pozicijų tai sunku paaiškinti. Daugiau genų nei Drosophila genų taip pat yra iššifruotame kryžmažiedžių šeimos augalo – Arabidopsis, genetikų plačiai naudojamo kaip klasikinis eksperimentinis objektas, genome.

Genominių projektų plėtrą lydėjo intensyvi daugelio mokslo ir technologijų sričių plėtra. Taigi bioinformatika gavo galingą impulsą jos plėtrai. Sukurtas naujas matematinis aparatas dideliems informacijos kiekiams saugoti ir apdoroti; sukurtos precedento neturinčios galios superkompiuterių sistemos; Parašyta tūkstančiai programų, kurios leidžia per kelias minutes atlikti lyginamąją įvairių informacijos blokų analizę, kasdien į kompiuterines duomenų bazes įvesti naujus duomenis,

gauti įvairiose pasaulio laboratorijose, o naują informaciją pritaikyti prie anksčiau sukauptos. Kartu buvo sukurtos sistemos, skirtos efektyviam įvairių genomo elementų išskyrimui ir automatiniam sekos nustatymui, tai yra DNR nukleotidų sekų nustatymui. Tuo remiantis buvo sukurti galingi robotai, kurie žymiai pagreitina sekos nustatymą ir daro jį pigesniu.

Genomikos plėtra savo ruožtu leido atrasti daugybę naujų faktų. Dar reikia įvertinti daugelio jų reikšmę

ateities. Tačiau jau dabar akivaizdu, kad šie atradimai paskatins permąstyti daugybę teorinių pozicijų dėl įvairių gyvybės formų Žemėje atsiradimo ir evoliucijos. Jie padės geriau suprasti atskirų ląstelių funkcionavimo ir jų sąveikos molekulinius mechanizmus; detalus daugelio dar nežinomų biocheminių ciklų dekodavimas;

jų ryšio su fundamentaliais fiziologiniais procesais analizė.

Taigi vyksta perėjimas nuo struktūrinės genomikos prie

funkcionalus, o tai savo ruožtu sukuria prielaidas

ląstelių ir viso organizmo funkcionavimo molekulinio pagrindo tyrimai.

Dabar sukaupta informacija bus analizuojama

ateinančius kelis dešimtmečius. Bet kiekvienas kitas žingsnis

skirtingų rūšių genomų struktūros iššifravimo kryptis, atsiranda naujų technologijų, palengvinančių informacijos gavimo procesą. Taigi,

duomenų apie žemesnių organizuotų rūšių gyvų būtybių genų sandarą ir funkciją panaudojimas gali gerokai paspartinti paiešką

pakeičia gana daug darbo reikalaujančius molekulinius genų paieškos metodus.

Svarbiausia konkrečios rūšies genomo struktūros iššifravimo pasekmė yra galimybė identifikuoti visus jos genus ir

atitinkamai transkribuotų RNR molekulių ir visų jos baltymų identifikavimas ir molekulinės prigimties nustatymas. Analogiškai su genomu gimė transkripto, jungiančio transkripcijos metu susidarantį RNR molekulių telkinį, ir iproteomo, apimančio daugybę genų koduojamų baltymų, sąvokos. Taigi genomika sukuria pagrindą intensyviai plėtoti naujus mokslus – proteomiką ir transkriptomika. Proteomika – tai kiekvieno baltymo struktūros ir funkcijos tyrimas; ląstelės baltymų sudėties analizė; atskiros ląstelės funkcionavimo molekulinio pagrindo nustatymas, kuris yra

daugelio šimtų baltymų koordinuoto darbo rezultatas ir

fenotipinio organizmo bruožo formavimosi tyrimas,

atsirandančių dėl milijardų ląstelių koordinuoto darbo.

Labai svarbūs biologiniai procesai vyksta ir RNR lygyje. Jų analizė yra transkriptomikos objektas.

Daugelio pasaulio šalių genomikos srityje dirbančių mokslininkų didžiausios pastangos buvo skirtos tarptautiniam projektui „Žmogaus genomas“ išspręsti. Didelė pažanga šioje srityje siejama su idėjos įgyvendinimu,

pasiūlė J. S. Venteris, ieškoti ir analizuoti

išreikštas DNR sekas, kurios vėliau gali būti naudojamos kaip tam tikros genomo regionų „žymės“ arba žymenys. Kitas savarankiškas ir ne mažiau vaisingas požiūris buvo naudojamas grupės, kuriai vadovavo kun.

Collinsas. Jis pagrįstas pirminiu paveldimų žmogaus ligų genų identifikavimu.

Žmogaus genomo struktūros iššifravimas atvedė prie sensacingo atradimo. Paaiškėjo, kad žmogaus genome yra tik 32 000 genų, o tai kelis kartus mažiau nei baltymų. Tuo pačiu metu yra tik 24 000 baltymus koduojančių genų, likusių genų produktai yra RNR molekulės.

DNR nukleotidų sekų panašumo procentas tarp skirtingų individų, etninių grupių ir rasių yra 99,9%.

Šis panašumas daro mus žmonėmis – Homo sapiens! Visas mūsų kintamumas nukleotidų lygyje telpa į labai kuklų skaičių – 0,1%.

Taigi genetika nepalieka vietos tautinio ar rasinio pranašumo idėjoms.

Bet pažiūrėkime vienas į kitą – mes visi skirtingi. Nacionaliniai, o juo labiau rasiniai skirtumai dar labiau pastebimi. Taigi koks mutacijų skaičius lemia žmogaus kintamumą ne procentais, o absoliučiais? Norėdami gauti šį įvertinimą, turite prisiminti, koks yra genomo dydis. Žmogaus DNR molekulės ilgis yra

3,2x109 bazinės poros. 0,1% iš to yra 3,2 milijono nukleotidų. Tačiau atminkite, kad koduojanti genomo dalis užima mažiau nei 3% viso DNR molekulės ilgio, o mutacijos už šio regiono ribų dažniausiai neturi jokios įtakos fenotipiniam kintamumui. Taigi, norėdami gauti vientisą mutacijų, turinčių įtakos fenotipui, skaičių, turime paimti 3% iš 3,2 milijono nukleotidų, o tai suteiks mums 100 000 skaičių, tai yra, apie 100 tūkstančių mutacijų sudaro mūsų fenotipą kintamumas. Jei palygintume šį skaičių su bendru genų skaičiumi, paaiškėtų, kad vidutiniškai vienam genui yra 3-4 mutacijos.

Kas yra šios mutacijos? Didžioji dauguma (ne mažiau kaip 70 proc.)

lemia mūsų individualų nepatologinį kintamumą, kas mus skiria, bet nepablogina vienas kito atžvilgiu. Tai apima tokias charakteristikas kaip akių spalva, plaukai, oda, kūno tipas, ūgis, svoris,

elgesio tipas, kuris taip pat daugiausia yra nulemtas genetiškai, ir daug daugiau. Apie 5% mutacijų yra susijusios su monogeninėmis ligomis. Maždaug ketvirtadalis likusių mutacijų priklauso funkcinių polimorfizmų klasei. Jie dalyvauja formuojant paveldimą polinkį į plačiai paplitusią daugiafaktorinę patologiją. Žinoma, šie skaičiavimai yra gana apytiksliai,

bet jie leidžia spręsti apie žmogaus paveldimo kintamumo struktūrą.

1.16 skyrius. Molekulinis genetinis evoliucijos pagrindas

Revoliucija molekulinės biologijos srityje, įvykusi tūkstantmečių sandūroje, pasibaigusi daugelio šimtų mikroorganizmų rūšių, taip pat kai kurių pirmuonių rūšių genomų struktūros iššifravimu,

mielės, augalai, gyvūnai ir žmonės, apvertė daugelį tradicinių klasikinės genetikos idėjų ir priartino galimybę ištirti molekulinius evoliucijos ir specifikacijos mechanizmus. Gimė naujas mokslas – lyginamoji genomika,

leidžiantis registruoti evoliuciškai reikšmingų įvykių, vykstančių atskirų molekulių lygmeniu, atsiradimą įvairiose filogenetinėse linijose. Paaiškėjo, kad apskritai evoliucijos pažanga siejama ne tik ir ne tiek su genų skaičiaus, masto ir netgi struktūrinės genų organizavimo sudėtingumo didėjimu, bet daug labiau su reguliavimo pasikeitimu. jų darbo, kuris lemia dešimčių tūkstančių genų raiškos koordinaciją ir audinių specifiškumą. Tai galiausiai paskatino aukštesniųjų organizmų sudėtingesnių, labai specifinių, daugiafunkcinių sąveikaujančių baltymų kompleksų, galinčių atlikti iš esmės naujas užduotis, atsiradimą.

Panagrinėkime pokyčių, vykstančių evoliucijos procese, pobūdį trimis informacijos lygmenimis: DNR – RNR – baltymas arba genomas – transkriptas – proteomas. Apskritai galime pasakyti, kad didėjant gyvenimo organizavimo sudėtingumui, didėja genomo dydis. Taigi prokariotų DNR dydis neviršija 8x106 bp, mielėse ir pirmuoniuose ji tampa dvigubai didesnė, vabzdžių – 10-15 kartų didesnė, o žinduoliams padidėjimas siekia 3 eiles, tai yra tūkstantį kartų (103). ).

Tačiau ši priklausomybė nėra tiesinė. Taigi žinduoliuose mes nebestebime reikšmingo genomo dydžio padidėjimo. Be to, ne visada įmanoma stebėti ryšį tarp genomo dydžio ir gyvenimo organizavimo sudėtingumo. Taigi kai kuriuose augaluose genomo dydis yra eilės tvarka ar net dviem eilėmis didesnis nei žmonių. Prisiminkime, kad eukariotų genomo dydžio padidėjimas, palyginti su prokariotais, daugiausia atsiranda dėl nekoduojančių sekų, tai yra, pasirenkamų elementų, atsiradimo. Jau sakėme, kad žmogaus genome egzonai iš viso sudaro ne daugiau kaip 1–3%. Tai reiškia, kad aukštesniuose organizmuose genų skaičius gali būti tik kelis kartus didesnis nei mikroorganizmuose.

Didėjantis eukariotų organizavimo sudėtingumas iš dalies paaiškinamas papildomos reguliavimo sistemos, būtinos

užtikrinantis genų ekspresijos audinių specifiškumą. Viena iš nenutrūkstamo genų organizavimo, atsiradusio eukariotuose, pasekmių buvo plačiai paplitęs alternatyvus sujungimas ir alternatyvi transkripcija. Tai paskatino daugybės genų atsiradimą nauja savybė – galimybė koduoti kelias funkciškai skirtingas baltymų izoformas. Taigi bendras baltymų kiekis

tai yra, proteomų dydis gali turėti kelis kartus didesnį genų skaičių.

Prokariotuose leistinas intraspecifinis genų skaičiaus kintamumas, ir

panašūs skirtumai tarp skirtingų daugelio mikroorganizmų padermių, in

įskaitant patogeninius, gali siekti keliasdešimt procentų. Be to, įvairių tipų mikroorganizmų organizavimo sudėtingumas tiesiogiai koreliuoja su koduojančių sekų skaičiumi ir ilgiu.

Taigi, fenotipinis vidinis ir tarpspecifinis kintamumas yra glaudžiai susijęs su labai panašiais transkripto ir proteomų dydžiais. Eukariotuose genų skaičius yra griežtai nustatyta rūšies charakteristika, o evoliucinio sudėtingumo didėjimas grindžiamas kitu principu – skirtingu kelių lygių riboto ir gana stabilaus proteomo įvairių komponentų panaudojimu.

Nematodų ir Drosophila genomų sekos nustatymas parodė, kad šių labai skirtingų rūšių proteomų dydžiai yra labai panašūs ir tik du kartus didesni nei mielių ir kai kurių bakterijų tipų. Šis modelis – reikšmingas įvairių gyvybės formų organizavimo sudėtingumo padidėjimas išlaikant arba santykinai nedidelis proteomo dydžio padidėjimas – būdingas visai vėlesnei evoliucijai iki žmonių. Taigi,

Žmonių ir pelių proteomos praktiškai nesiskiria viena nuo kitos ir yra mažiau nei 2 kartus didesnės už mikroskopinio nematodo apvaliosios kirmėlės ar vaisinės musės Drosophila proteomas. Be to, žmogaus DNR nukleotidų sekų tapatumas ir

didžiosios beždžionės yra 98,5%, o kodavimo regionuose siekia 99%. Šie skaičiai mažai skiriasi nuo 99,9 proc.

nustatant specifinį DNR nukleotidų sekų panašumą tarp skirtingų individų, tautų ir rasių, gyvenančių mūsų planetoje. Taigi kokie pokyčiai, sudarantys ne daugiau kaip 1,5% viso genomo, yra esminiai žmogaus formavimuisi? Atsakymo į šį klausimą, matyt, reikėtų ieškoti ne tik genominiame ir proteominiame lygmenyse.

Iš tiesų, kartu su santykiniu proteomo stabilumu, in

Evoliucijos procese staigiai didėja eukariotinės transkripto organizacijos dydis ir sudėtingumas dėl to, kad genome atsiranda daugybė transkribuotų ir nekoduojančių DNR, taip pat dėl ​​reikšmingo DNR išsiplėtimo. RNR koduojančių genų klasė. RNR, kurios nekoduoja baltymų, kurių pagrindinis šaltinis yra intronai,

sudaro didžiąją dalį aukštesniųjų organizmų transkripto,

siekia 97-98% visų transkripcijos vienetų. Šiuo metu intensyviai analizuojamos šių molekulių funkcijos.

Taigi, pagrindiniai evoliuciniai pokyčiai vyksta didėjant genomo dydžiui, gana stabiliam proteomui ir staigiai padidėjus transkripto dydžiui – Fig. 31.

31 pav. Evoliuciniai pokyčiai, vykstantys trimis

informacijos lygiai Tuo pat metu akivaizdus perėjimas nuo paprastų gyvenimo formų prie sudėtingesnių

koreliuoja su dviejų pagrindinių ir tam tikru mastu tarpusavyje susijusių evoliucinių įgijimų atsiradimu ir plačiai paplitimu genome: nekoduojančios DNR ir pasikartojančių elementų. Tiesioginė šių pokyčių, vykstančių genomo lygiu, pasekmė yra daugybės nekoduojančių baltymų RNR atsiradimas evoliucijos procese.

Koks yra šių evoliucinių transformacijų struktūrinis pagrindas?

Visus pagrindinius evoliucinius perėjimus: nuo prokariotų iki eukariotų, nuo pirmuonių iki metazoanų, nuo pirmųjų gyvūnų iki dvišalių gyvūnų ir nuo primityvių akordų iki stuburinių, labai padidėjo genomo sudėtingumas. Matyt, tokie evoliucijos šuoliai yra retų atvejų, kai sėkmingai sujungiami ištisi skirtingų rūšių genomai, priklausantys sisteminėms klasėms, kurios gerokai nutolusios viena nuo kitos. Taigi, Archaea ir Bakterijų simbiozė pažymėjo perėjimo nuo prokariotų prie eukariotų pradžią. Akivaizdu, kad dėl endosimbiozės taip pat atsirado mitochondrijos, chloroplastai ir kai kurios kitos ląstelių organelės. Pagrindinė aukštesniųjų eukariotų savybė – diploidija – atsirado dėl gerai reguliuojamo genomo dubliavimosi, įvykusio maždaug prieš 500 milijonų metų.

Genominis dubliavimasis rūšies viduje įvyko gana dažnai ir

to pavyzdžiai yra daugybė augalų poliploidijos atvejų,

grybai ir net kartais gyvūnai. Tačiau galimi mechanizmai

Iš esmės naujų gyvybės formų atsiradimą evoliucijos procese lemia ne autopoliploidija, o hibridizacija ir horizontalus genomų perkėlimas arba susiliejimas. Pastebėtina, kad reikšmingiausios evoliucinės transformacijos, lydimos ištisų genomų susiliejimo, vyksta ypatingomis sąlygomis, didelių geologinių perėjimų laikotarpiais, pavyzdžiui, deguonies koncentracijos pokyčiai atmosferoje, Žemės apledėjimas ar Kambras. Sprogimas.

Santykinai ramiomis geologinėmis sąlygomis evoliucijai reikšmingesni yra atskirų genų arba chromosomų segmentų dubliavimasis su vėlesniu jų skirtumu. Palyginus sekvenuotų genomų nukleotidų sekas, matyti, kad genų dubliavimosi dažnis yra gana didelis ir vidutiniškai yra 0,01 vienam genui per milijoną metų. Didžioji dauguma jų nepasireiškia per ateinančius kelis milijonus metų ir tik retais atvejais

Kai kuriais atvejais pasikartojantys genai gali įgyti naujų adaptacinių funkcijų. Tačiau didelė „tyliųjų“ genų dubliavimosi klasė yra tam tikras rezervinis fondas naujiems genams gimti ir naujų rūšių formavimuisi. Žmogaus genome yra nuo 10 iki 20 tūkstančių apdorotų genų kopijų, atsiradusių dėl mRNR retropozicijos.

Dauguma jų priklauso pseudogenų klasei, tai yra, jie nėra išreikšti nei dėl mutacijų buvimo, nei dėl įterpimų į transkripciškai neaktyvius genomo regionus. Tačiau kai kurie iš šių genų yra aktyvūs, o jų ekspresijos pobūdis ir net funkcijos gali skirtis,

nei įkūrėjų genų.

Jie vaidina ypatingą vaidmenį primatų ir žmonių evoliucijoje. segmentiniai dubliavimai, priklausantis mažai kopijų pasikartojimų (LCR) klasei ir

atsirado mažiau nei prieš 35 milijonus metų. Šios sekos yra labai identiški DNR blokai, kurių dydis skiriasi nuo vieno iki kelių šimtų kilobazių. Dažniausiai segmentinės dubliacijos yra lokalizuotos įvairių chromosomų pericentromerinėse arba telomerinėse srityse, o iš viso jos užima apie 5% žmogaus genomo.

Kituose sekvenuotuose genomuose segmentinių dubliavimų nerasta.

Minimalus segmentinio dubliavimo modulis, vadinamas dublikonu, turi nesusijusių neapdorotų genų fragmentų ir

tai išskiria jį iš kitų žinomų kartotinių sekų tipų. Tam tikromis sąlygomis dublikonai gali būti šaltiniai kuriant naujus chimerinius transkribuotus genus arba genų šeimas iš įvairių juose esančių koduojančių egzonų derinių. Apskaičiuota, kad šimpanzės ir žmogaus genomus gali atskirti nuo 150 iki 350 genų.

Nemenkindami naujų kodavimo sekų atsiradimo ir senų kodavimo sekų išnykimo svarbos, turėtume pabrėžti realią kitų mechanizmų egzistavimo galimybę,

vaidina lemiamą vaidmenį eukariotų evoliucijoje.

Vienas iš varomųjų evoliucijos mechanizmų yra mobilūs elementai, randami visose šiuo atžvilgiu tirtose rūšyse.

Genominiai pokyčiai, susiję su specifikacijos procesu, gali apimti didelius kariotipo pertvarkymus, vietinius chromosomų pertvarkymus, genų šeimų dubliavimą, atskirų genų modifikacijas,

lydimas jų gimimo ar praradimo, taip pat genų ekspresijos skirtumai, reguliuojami tiek transkripcijos, tiek sujungimo ar transliacijos lygiu. Mobilieji elementai yra tiesiogiai susiję su visais šiais procesais.

Kai kuriais atvejais patys perkeliami elementai turi sekas, koduojančias fermentus, kurių buvimas yra būtinas DNR perkėlimui arba RNR retropozicijai.

Panašios sekos yra ir retrovirusų genome, LTR-

elementai ir transpozonai. Retrotranspozonai taip pat apima daugiausiai perkeliamų elementų klasę – Alu kartojasi. Pirmą kartą Alu-

pasikartojimai atsiranda primatuose maždaug prieš 50-60 milijonų metų iš mažo RNR koduojančio geno. Tolesnės evoliucijos procese atsiranda šios šeimos skirtumai ir galingas sustiprėjimas. Perėjimą nuo primatų prie žmonių lydi sparčiai didėjantis jų skaičius

Alu kartoja, kurio kopijų skaičius, kai kuriais vertinimais, siekia

1,1 mln. Alu pakartojimai užima apie 10% žmogaus genomo, tačiau jų pasiskirstymas yra netolygus, nes dažniausiai yra susiję su genais. Šie elementai retai būna koduojančiuose egzonuose ir gana dažnai randami intronuose ir nekoduojančiuose mRNR regionuose, darydami įtaką šių molekulių stabilumui ir (arba) transliacijos efektyvumui. Alu sekų buvimas introniniuose genų regionuose gali būti susijęs su preRNR apdorojimo pobūdžio pasikeitimu, nes šiose sekose yra regionų, homologiškų donoro ir akceptoriaus sujungimo vietoms. Kai Alu elementai įterpiami į reguliuojančias geno sritis, gali būti sutrikdyta transkripcija, todėl

Šokinėjimo genai

Praėjusio amžiaus viduryje amerikiečių tyrinėtoja Barbara McClintock atrado nuostabius genus kukurūzuose, kurie gali savarankiškai pakeisti savo padėtį chromosomose. Dabar jie vadinami „šokinėjančiais genais“ arba perkeliamais (mobiliais) elementais. Atradimas ilgą laiką nebuvo pripažintas, mobiliuosius elementus laikant unikaliu reiškiniu, būdingu tik kukurūzams. Tačiau būtent už šį atradimą McClintock 1983 metais buvo apdovanotas Nobelio premija – šiandien šokinėjimo genai buvo rasti beveik visose tirtose gyvūnų ir augalų rūšyse.

Iš kur atsirado šokinėjimo genai, ką jie veikia ląstelėje, ar jie naudingi? Kodėl turėdami genetiškai sveikus tėvus Drosophila vaisinių muselių šeima dėl šokinėjančių genų gali dažnai susilaukti mutantų palikuonių ar net būti bevaikė? Koks yra šokinėjančių genų vaidmuo evoliucijoje?

Reikia pasakyti, kad genai, užtikrinantys ląstelių funkcionavimą, išsidėstę chromosomose tam tikra tvarka. Dėl to buvo galima sudaryti daugelio vienaląsčių ir daugialąsčių organizmų rūšių vadinamuosius genetinius žemėlapius. Tačiau tarp genų yra daug daugiau genetinės medžiagos nei juose! Kokį vaidmenį atlieka ši „balastinė“ DNR dalis, iki galo nenustatyta, tačiau būtent čia dažniausiai randami mobilūs elementai, kurie ne tik patys juda, bet ir gali su savimi pasiimti gretimus DNR fragmentus.

Iš kur atsiranda šokinėjimo genai? Daroma prielaida, kad bent dalis jų yra kilę iš virusų, nes kai kurie judrūs elementai gali sudaryti virusines daleles (pavyzdžiui, vaisinės muselės judrus elementas cipsy Drosophila melanogaster). Kai kurie mobilieji elementai genome atsiranda per vadinamuosius horizontalus perkėlimas iš kitų rūšių. Pavyzdžiui, nustatyta, kad mobilusis valkata-elementas (išvertus į rusų kalbą vadinamas valkata) Drosophila melanogaster pakartotinai įtrauktas į šios rūšies genomą. Yra versija, kad kai kurios DNR reguliavimo dalys taip pat gali turėti savarankiškumą ir polinkį į „valgyti“.

Naudingas balastas

Kita vertus, dauguma šokinėjančių genų, nepaisant pavadinimo, elgiasi tyliai, nors sudaro penktadalį visos genetinės medžiagos. Drosophila melanogaster arba beveik pusė žmogaus genomo.

Aukščiau minėtas DNR perteklius turi savo pranašumą: balastinė DNR (įskaitant pasyvius mobiliuosius elementus) nukenčia, jei į genomą patenka svetima DNR. Tikimybė, kad naujas elementas bus integruotas į naudingą geną ir taip sutrikdys jo funkciją, sumažėja, jei balastinės DNR yra daug daugiau nei reikšmingos DNR.

Tam tikras DNR perteklius naudingas taip pat, kaip ir raidžių „perteklius“ žodžiuose: rašome „Maria Ivanovna“, bet sakome „Marivan“. Kai kurios raidės neišvengiamai prarandamos, bet prasmė išlieka. Tas pats principas veikia ir atskirų aminorūgščių reikšmės lygmenyje baltymo-fermento molekulėje: griežtai išsaugoma tik aminorūgščių seka, kuri sudaro aktyvųjį centrą. Taigi, skirtinguose lygiuose atleidimas yra tam tikras buferis, suteikiantis sistemos stiprumo rezervą. Taip mobilieji elementai, praradę mobilumą, pasirodo, nėra nenaudingi genomui. Kaip sakoma, „iš plonos avies bent kuokštelis vilnos“, nors galbūt čia labiau tiktų kita patarlė – „kiekvienas basas iš eilės“.

Mobilieji elementai, išlaikę galimybę šokinėti, juda išilgai Drosophila chromosomų 10–2–10–5 dažniu vienam genui per kartą, priklausomai nuo elemento tipo, genetinio fono ir išorinių sąlygų. Tai reiškia, kad vienas iš šimto šokinėjančių genų ląstelėje gali pakeisti savo padėtį po kito ląstelės dalijimosi. Dėl to po kelių kartų judriųjų elementų pasiskirstymas išilgai chromosomos gali labai smarkiai pasikeisti.

Šį pasiskirstymą patogu tirti politeninėse (daugiagrandėse) chromosomose iš Drosophila lervų seilių liaukų. Šios chromosomos yra daug kartų storesnės nei įprastai, o tai labai supaprastina jų tyrimą mikroskopu. Kaip gaunamos tokios chromosomos? Seilių liaukų ląstelėse kiekvienos chromosomos DNR dauginasi, kaip ir normaliai dalijantis ląstelėms, tačiau pati ląstelė nesidalija. Dėl to ląstelių skaičius liaukoje nekinta, tačiau per 10-11 ciklų kiekvienoje chromosomoje susikaupia keli tūkstančiai vienodų DNR grandinių.

Iš dalies dėl politeno chromosomų Drosophila šokinėjimo genai yra geriau ištirti nei kitų daugialąsčių organizmų. Dėl šių tyrimų paaiškėjo, kad net toje pačioje Drosophila populiacijoje sunku rasti du individus, kurių chromosomos būtų vienodos perkeliamų elementų pasiskirstymo. Neatsitiktinai manoma, kad daugumą spontaniškų Drosophila mutacijų sukelia šių „šokėjų“ judėjimas.

Pasekmės gali būti įvairios...

Remiantis jų poveikiu genomui, aktyvius judrius elementus galima suskirstyti į kelias grupes. Kai kurie iš jų atlieka genomui itin svarbias ir naudingas funkcijas. Pavyzdžiui, telomerinis DNR, esanti Drosophila chromosomų galuose, susideda iš specialių mobiliųjų elementų. Ši DNR yra nepaprastai svarbi - jos praradimas reiškia visos chromosomos praradimą ląstelių dalijimosi metu, o tai lemia ląstelių mirtį.

Kiti mobilieji elementai yra tiesioginiai „kenkėjai“. Bent jau šiuo metu jie taip laikomi. Pavyzdžiui, mobilieji R2 klasės elementai gali būti specialiai įtraukti į nariuotakojų genus, koduojančius vieną iš ribosomų baltymų, ląstelių baltymų sintezės „gamyklas“. Tokių sutrikimų turintys asmenys išgyvena tik todėl, kad genome yra pažeista tik dalis daugelio šiuos baltymus koduojančių genų.

Taip pat yra judrių elementų, kurie juda tik reprodukciniuose audiniuose, gaminančiuose lytines ląsteles. Tai paaiškinama tuo, kad skirtinguose audiniuose tas pats judrus elementas gali gaminti judėjimui reikalingas fermentų baltymų molekules, kurios skiriasi ilgiu ir funkcija.

Pastarojo pavyzdys yra P elementas Drosophila melanogaster, kuris į savo natūralias populiacijas pateko horizontaliai pernešant iš kitos Drosophila rūšies ne daugiau kaip prieš šimtą metų. Tačiau dabar Žemėje beveik nėra gyventojų Drosophila melanogaster, kuriame P elementas nebūtų rastas. Pažymėtina, kad dauguma jo kopijų yra brokuotos, be to, beveik visur buvo rasta ta pati defekto versija. Pastarojo vaidmuo genome yra unikalus: jis „netoleruoja“ savo bendraminčių ir atlieka represoriaus vaidmenį, blokuodamas jų judėjimą. Taigi Drosophila genomo apsaugą nuo „svetimo“ šuolių iš dalies gali atlikti jo paties dariniai.

Svarbiausia pasirinkti tinkamus tėvus!

Dauguma mobiliųjų elementų šuolių neturi įtakos Drosophila išvaizdai, nes jie atsiranda ant balastinės DNR, tačiau yra ir kitų situacijų, kai jų aktyvumas smarkiai padidėja.

Keista, bet galingiausias veiksnys, skatinantis šokinėjančių genų judėjimą, yra prasta tėvų atranka. Pavyzdžiui, kas atsitiks, jei sukryžminsite pateles iš laboratorinės populiacijos? Drosophila melanogaster, kurie neturi P elemento (nes jų protėviai buvo pagauti iš gamtos maždaug prieš šimtą metų), o patinai neša P elementą? Hibriduose dėl greito judriojo elemento judėjimo gali atsirasti daug įvairių genetinių sutrikimų. Šį reiškinį, vadinamą hibridine disgeneze, sukelia tai, kad motinos citoplazmoje nėra represoriaus, kuris uždraustų perkeliamo elemento judėjimą.

Taigi, jei jaunikis iš populiacijos A ir nuotakos iš populiacijos B gali sukurti daugiavaikes šeimas, tai ne visada yra priešingai. Genetiškai sveikų tėvų šeima gali susilaukti daug mutantinių ar nevaisingų palikuonių ar net būti bevaikė, jei tėvo ir motinos genome yra skirtingas judriųjų elementų rinkinys. Ypač daug pažeidimų atsiranda, jei eksperimentas atliekamas 29° C temperatūroje. Išorinių veiksnių įtaka, esanti ant genetinio fono, sustiprina genomo neatitikimo efektą, nors patys vieni šie veiksniai (netgi jonizuojanti spinduliuotė) nėra pajėgūs. sukelti tokius didžiulius mobiliųjų elementų judesius.

Panašūs įvykiai Drosophila melanogaster gali atsirasti dalyvaujant kitoms mobiliųjų elementų šeimoms.

„Mobilioji“ evoliucija

Ląstelių genomą galima laikyti savotiška nuolatinių ir laikinų narių ekosistema, kurioje kaimynai ne tik sugyvena, bet ir sąveikauja tarpusavyje. Šeimininkų genų sąveika su judriais elementais vis dar menkai suprantama, tačiau galima duoti daug rezultatų – nuo ​​organizmo žūties svarbaus geno pažeidimo atveju iki anksčiau pažeistų funkcijų atkūrimo.

Pasitaiko, kad patys šokinėjantys genai sąveikauja tarpusavyje. Taigi žinomas imunitetą primenantis reiškinys, kai mobilusis elementas negali prasiskverbti arti jau esančio. Tačiau ne visi mobilieji elementai yra tokie subtilūs: pavyzdžiui, P elementai gali lengvai prasiskverbti vienas į kitą ir ištraukti kitus žaidėjus iš žaidimo.

Be to, genome yra tam tikra mobiliųjų elementų skaičiaus savireguliacija. Faktas yra tas, kad mobilieji elementai gali keistis homologiniais regionais vienas su kitu - šis procesas vadinamas rekombinacija. Dėl tokios sąveikos mobilieji elementai, priklausomai nuo jų orientacijos, gali prarasti ( ištrynimas) arba išplėsti ( inversija) tarp jų išsidėstę šeimininko DNR fragmentai. Jei prarandama reikšminga chromosomos dalis, genomas mirs. Inversijos ar nedidelės delecijos atveju sukuriama chromosomų įvairovė, kuri laikoma būtina evoliucijos sąlyga.

Jei vyksta rekombinacijos tarp judrių elementų, esančių skirtingose ​​chromosomose, susidaro chromosomų persitvarkymai, kurie vėlesnio ląstelių dalijimosi metu gali sukelti genomo disbalansą. O nesubalansuotas genomas, kaip ir nesubalansuotas biudžetas, yra padalintas labai prastai. Taigi nesėkmingų genomų mirtis yra viena iš priežasčių, kodėl aktyvūs judrūs elementai neužpildo chromosomų neribotą laiką.

Kyla natūralus klausimas: kiek reikšmingas mobiliųjų elementų indėlis į evoliuciją? Pirma, dauguma mobiliųjų elementų yra įvedami, grubiai tariant, visur, kur jie turi būti, todėl jie gali pažeisti arba pakeisti geno, į kurį jie yra įvesti, struktūrą ar reguliavimą. Tada natūrali atranka atmeta nesėkmingus variantus, o sėkmingi variantai su prisitaikančiomis savybėmis yra fiksuojami.

Jei mobiliojo elemento įvedimo pasekmės pasirodys neutralios, šis variantas gali išlikti populiacijoje, suteikdamas tam tikrą genų struktūros įvairovę. Tai gali praversti nepalankiomis sąlygomis. Teoriškai, masiškai judant mobiliesiems elementams, mutacijos vienu metu gali atsirasti daugelyje genų, kurios gali būti labai naudingos smarkiai pasikeitus gyvenimo sąlygoms.

Taigi, apibendrinant: genome yra daug mobiliųjų elementų ir jie yra skirtingi; jie gali sąveikauti tiek tarpusavyje, tiek su šeimininko genais; gali pakenkti ir būti nepakeičiamas. Genomo nestabilumas, kurį sukelia judrių elementų judėjimas, gali baigtis tragiškai individui, tačiau gebėjimas greitai keistis yra būtina sąlyga populiacijos ar rūšies išlikimui. To dėka sukuriama įvairovė, kuri yra natūralios atrankos ir vėlesnių evoliucinių transformacijų pagrindas.

Galima nubrėžti analogiją tarp šokinėjančių genų ir imigrantų: vieni imigrantai ar jų palikuonys tampa lygiaverčiais piliečiais, kitiems išduodami leidimai gyventi, o kiti – nesilaikantys įstatymų – ištremiami arba įkalinami. O masinės žmonių migracijos gali greitai pakeisti pačią valstybę.

Literatūra

Ratner V. A., Vasilyeva L. A. Mobiliųjų genetinių elementų transpozicijų indukcija streso įtaka. Rusiškas įrišimas. 2000 m.

Gvozdevas V. A. Mobili eukariotų DNR // Soroso edukacinis žurnalas. 1998. Nr.8.

Leidykla „BINOM. Žinių laboratorija išleidžia genetiko Craigo Venterio atsiminimų knygą „Gyvenimas iššifruotas“. Craigas Venteris yra žinomas dėl savo darbų, susijusių su žmogaus genomo skaitymu ir iššifravimu. 1992 m. jis įkūrė Genomo tyrimų institutą (TIGR). 2010 metais Venteris sukūrė pirmąjį pasaulyje dirbtinį organizmą – sintetinę bakteriją Mycoplasma laboratorium. Kviečiame perskaityti vieną iš knygos skyrių, kuriame Craigas Venteris pasakoja apie 1999–2000 m. darbus, siekiant sekvenuoti musės Drosophila genomo.

Pirmyn ir tik pirmyn

Pamatiniai paveldimumo aspektai, mūsų nuostabai, pasirodė gana paprasti, todėl buvo vilties, kad galbūt gamta nėra tokia nepažinta, o jos nesuprantamumas, ne kartą skelbiamas įvairių žmonių, tėra dar viena iliuzija, mūsų neišmanymo vaisius. . Tai mus nuteikia optimistiškai, nes jei pasaulis būtų toks sudėtingas, kaip teigia kai kurie mūsų draugai, biologija neturėtų jokių šansų tapti tiksliuoju mokslu.

Tomas Huntas Morganas. Fizinis paveldimumo pagrindas

Daugelis žmonių manęs klausė, kodėl iš visų mūsų planetoje esančių gyvų būtybių pasirinkau vaisinę musę; kiti stebėjosi, kodėl iš karto neperėjau prie žmogaus genomo iššifravimo. Esmė ta, kad mums reikėjo pagrindo būsimiems eksperimentams, norėjome įsitikinti savo metodo teisingumu prieš išleisdami beveik 100 milijonų dolerių žmogaus genomo sekos nustatymui.

Mažoji vaisinė muselė vaidino didžiulį vaidmenį vystant biologiją, ypač genetiką. Drosophila gentis apima įvairias muses – acto, vyno, obuolių, vynuogių, vaisių – iš viso apie 26 šimtus rūšių. Tačiau ištarkite žodį „drosophila“ ir bet kuris mokslininkas iškart pagalvos apie vieną konkrečią rūšį – Drosophilamelanogaster. Kadangi ši mažytė muselė dauginasi greitai ir lengvai, ji tarnauja kaip pavyzdinis organizmas evoliuciniams biologams. Ją jie naudoja siekdami nušviesti kūrimo stebuklą – nuo ​​apvaisinimo momento iki suaugusio organizmo atsiradimo. Drosofilos dėka buvo padaryta daug atradimų, įskaitant homeobokso turinčius genus, reguliuojančius bendrą visų gyvų organizmų struktūrą.

Kiekvienas genetikos studentas yra susipažinęs su Amerikos genetikos tėvo Thomaso Hunto Morgano eksperimentais su Drosophila. 1910 metais tarp įprastų raudonakių musių jis pastebėjo mutantų patinus baltomis akimis. Jis sukryžmino baltaakį patiną su raudonakėmis patele ir nustatė, kad jų palikuonys buvo raudonakės: baltaakis pasirodė esantis recesyvinis požymis, o dabar žinome, kad norint, kad musės turėtų baltas akis, reikia dviejų kopijų. baltų akių geno, po vieną iš kiekvieno iš tėvų. Toliau kryžmindamas mutantus, Morganas išsiaiškino, kad baltų akių bruožą turi tik vyrai, ir padarė išvadą, kad šis bruožas buvo susijęs su lytine chromosoma (Y chromosoma). Morganas ir jo mokiniai tyrinėjo paveldimus vaisinių muselių bruožus. Šiandien eksperimentai su Drosophila atliekami molekulinės biologijos laboratorijose visame pasaulyje, kur daugiau nei penki tūkstančiai žmonių tiria šį nedidelį vabzdį.

Drosophila svarbą sužinojau iš pirmų rankų, kai panaudojau jos cDNR genų bibliotekas adrenalino receptoriams tirti ir atradau jų atitikmenį musės – oktopamino receptoriuose. Šis atradimas parodė musės ir žmogaus nervų sistemos evoliucinio paveldimumo bendrumą. Bandydamas suprasti žmogaus smegenų cDNR bibliotekas, radau panašių funkcijų genų, kompiuteriniu būdu palygindamas žmogaus genus su Drosophila genais.

Drosophila genų sekos nustatymo projektas prasidėjo 1991 m., kai Jerry Rubinas iš Kalifornijos universiteto Berklyje ir Allenas Spradlingas iš Carnegie instituto nusprendė, kad laikas imtis šios užduoties. Iki 1998 m. gegužės mėn. 25% sekų jau buvo užbaigta, ir aš pateikiau pasiūlymą, kuris, Rubino teigimu, buvo „per geras, kad jį praleistume“. Mano idėja buvo gana rizikinga: tūkstančiams vaisinių muselių tyrinėtojų iš skirtingų šalių tektų atidžiai išnagrinėti kiekvieną mūsų gauto kodo raidę, palyginti ją su paties Džerio aukštos kokybės pamatiniais duomenimis ir tada padaryti išvadą apie mano metodo tinkamumą. .

Pradinis planas buvo užbaigti musės genomo sekos nustatymą per šešis mėnesius iki 1999 m. balandžio mėn., o tada pradėti ataką prieš žmogaus genomą. Man atrodė, kad tai buvo veiksmingiausias ir aiškiausias būdas parodyti, kad mūsų naujasis metodas veikia. Ir jei mums nepavyks, pagalvojau, geriau būtų greitai tai patikrinti naudojant Drosophila pavyzdį, o ne dirbti su žmogaus genomu. Tačiau iš tikrųjų visiška nesėkmė būtų pati įspūdingiausia nesėkmė biologijos istorijoje. Džeris taip pat kenkė savo reputacijai, todėl visi „Celera“ buvo pasiryžę jį palaikyti. Paprašiau Marko Adamso vadovauti mūsų projekto daliai, o kadangi Jerry taip pat turėjo aukščiausios klasės komandą Berklyje, mūsų bendradarbiavimas vyko sklandžiai.

Visų pirma, iškilo klausimas dėl DNR, kurią turėjome sekti, grynumo. Kaip ir žmonės, musės skiriasi genetiniu lygmeniu. Jei populiacijoje yra daugiau nei 2% genetinės variacijos, o pasirinktoje grupėje yra 50 skirtingų individų, dekoduoti pasirodo labai sunku. Pirmasis Džerio žingsnis buvo kuo daugiau musių giminystės, kad gautume vienodą DNR variantą. Tačiau genetiniam grynumui užtikrinti nepakako giminingo giminystės: išskiriant musės DNR kildavo pavojus užkrėsti genetine medžiaga iš musės maiste arba jos žarnyne esančių bakterijų ląstelių. Norėdamas išvengti šių problemų, Džeris mieliau išskyrė DNR iš musių embrionų. Tačiau net ir iš embrioninių ląstelių pirmiausia turėjome išskirti branduolius su reikalinga DNR, kad neužterštume jų mitochondrijų – ląstelės „jėgainių“ – ekstrabranduoline DNR. Dėl to gavome mėgintuvėlį su drumstu grynos Drosophila DNR tirpalu.

1998 m. vasarą Hamo komanda, turėdama tokią gryną musės DNR, pradėjo kurti jos fragmentų bibliotekas. Pats Hamas labiausiai mėgo pjaustyti DNR ir perdengti susidariusius fragmentus, taip sumažindamas klausos aparato jautrumą, kad jokie pašaliniai garsai atitrauktų jo nuo darbo. Bibliotekų kūrimas turėjo būti didelio masto eiliškumo pradžia, tačiau iki šiol visur buvo girdėti tik grąžtų, plaktukų ir pjūklų garsai. Šalia nuolat rėžėsi visa armija statybininkų, o mes toliau sprendėme svarbiausias problemas – sekvencerių, robotų ir kitos įrangos veikimo trikčių šalinimą, stengėmės ne per metus, o per kelis mėnesius sukurti tikrą sekvenavimo „fabriką“. “ nuo nulio.

Pirmasis 3700 modelio DNR sekvenavimo įrenginys buvo pristatytas Celera 1998 m. gruodžio 8 d. su dideliu susijaudinimu ir kolektyviniu palengvėjimu. Prietaisas buvo ištrauktas iš medinės dėžės, patalpintas į rūsyje esančią patalpą be langų – jo laikinuosius namus ir tuoj pat pradėtas testavimas. Pradėjus veikti, gavome labai kokybiškus rezultatus. Tačiau šie ankstyvieji sekvenatoriai buvo gana nestabilūs, o kai kurie buvo sugedę nuo pat pradžių. Taip pat nuolat kildavo problemų su darbuotojais, kartais beveik kasdien. Pavyzdžiui, roboto manipuliatoriaus valdymo programoje atsirado rimta klaida – kartais roboto mechaninė ranka dideliu greičiu išsitiesdavo virš įrenginio ir atsitrenkdavo į sieną. Dėl to sekveneris sustojo ir reikėjo kviesti remonto komandą, kad ją sutvarkytų. Kai kurie sekvenatoriai sugedo dėl klaidinančių lazerio spindulių. Apsaugai nuo perkaitimo buvo naudojama folija ir juosta, nes aukštoje temperatūroje geltonos spalvos Gs fragmentai išgaravo iš sekų.

Nors dabar įrenginiai buvo reguliariai tiekiami, apie 90 % jų nuo pat pradžių buvo sugedę. Kai kuriomis dienomis sekvenatoriai visai neveikė. Tvirtai tikėjau Mike'u Hunkapilleriu, bet mano tikėjimas labai susvyravo, kai jis ėmė kaltinti mūsų darbuotojus, statybų dulkes, menkiausius temperatūros svyravimus, mėnulio fazes ir pan. Kai kurie iš mūsų net papilkėjo nuo streso.

Mirę 3700-ieji sėdėjo kavinėje ir laukė, kol bus išsiųsti atgal į ABI, ir galiausiai viskas pasiekė tokį tašką, kad pietus turėjome valgyti praktiškai sekvencininkų morge. Buvau apimta nevilties – juk man kasdien reikėjo tam tikro skaičiaus veikiančių prietaisų, būtent 230! Už maždaug 70 milijonų dolerių ABI pažadėjo mums suteikti arba 230 puikiai veikiančių įrenginių, kurie veiktų visą dieną be pertrūkių, arba 460, kurie veiktų bent pusę dienos. Be to, Mike'as turėjo padvigubinti kvalifikuoto techninio personalo skaičių, kuris po gedimo iš karto suremontuotų sekvenerius.

Tačiau koks interesas visa tai daryti už tuos pačius pinigus! Be to, Mike'as dabar turi dar vieną klientą – vyriausybės genominį projektą, kurio vadovai jau pradėjo pirkti šimtus įrenginių be jokių bandymų. „Celera“ ateitis priklausė nuo šių sekvencerių, tačiau Maikas, matyt, nesuvokė, kad ABI ateitis taip pat priklausė nuo jų. Konfliktas buvo neišvengiamas, kaip buvo akivaizdu per svarbų ABI inžinierių ir mano komandos susitikimą Celeroje.

Po to, kai pranešėme apie didžiulį sugedusių instrumentų skaičių ir tai, kiek laiko užtruko sekvencerių gedimų taisymas, Mike'as vėl bandė visą kaltę suversti mano darbuotojams, tačiau net jo paties inžinieriai su juo nesutiko. Galiausiai įsikišo Tony White. „Man nerūpi, kiek tai kainuoja arba kas turi būti nužudytas“, – sakė jis. Tada pirmą ir paskutinį kartą jis tikrai stojo į mano pusę. Jis įsakė Mike'ui kuo greičiau užtikrinti naujų sekvencerių pristatymą, net ir kitų klientų sąskaita ir net jei dar nežinoma, kiek tai kainuos.

Tonis taip pat įsakė Mike'ui pasamdyti dar dvidešimt technikų, kurie greitai ištaisytų ir nustatytų visų problemų priežastį. Iš tikrųjų tai buvo lengviau pasakyti nei padaryti, nes trūko patyrusių darbuotojų. Pradžioje Ericas Landeris išviliojo du labiausiai kvalifikuotus inžinierius, ir, Mike'o nuomone, mes taip pat buvome kalti. Kreipdamasis į Marką Adamsą, Mike'as pasakė: „Turėjai juos pasamdyti anksčiau, nei kas nors kitas“. Po tokio pareiškimo visiškai praradau jam bet kokią pagarbą. Juk pagal mūsų susitarimą aš negalėjau samdyti ABI darbuotojų, o Landeris ir kiti vyriausybinio genomo projekto vadovai turėjo teisę tai daryti, tad labai greitai geriausi ABI inžinieriai pradėjo dirbti pas mūsų konkurentus. Susitikimo pabaigoje supratau, kad problemos išliko, tačiau sužibo vilties spindulėlis pagerėti.

Taip ir atsitiko, nors ir ne iš karto. Mūsų sekvencerių arsenalas išaugo nuo 230 iki 300 įrenginių, o jei 20-25% jų sugesdavo, dar turėjome apie 200 veikiančių sekvencerių ir kažkaip susitvarkėme su užduotimis. Techninis personalas dirbo didvyriškai ir nuolat didino remonto darbų tempą, sumažindamas prastovų laiką. Visą šį laiką galvojau apie vieną dalyką: tai, ką darome, yra įmanoma. Nesėkmės įvyko dėl tūkstančio priežasčių, bet nesėkmės nebuvo mano planų dalis.

Drosophila genomo seką pradėjome rimtai nustatyti balandžio 8 d., maždaug tuo metu, kai turėjome baigti šį darbą. Aš, žinoma, supratau, kad White'as nori manimi atsikratyti, bet padariau viską, ką galiu, kad atlikčiau pagrindinę užduotį. Namuose mane persekiojo įtampa ir nerimas, bet negalėjau šių problemų aptarti su savo „patikėtiniu“. Klerė parodė savo panieką, kai pamatė, kaip aš esu susirūpinęs Seleros reikalais. Ji jautė, kad kartočiau tas pačias klaidas, kurias padariau dirbdamas TIGR/HGS. Iki liepos 1 d. jaučiausi giliai prislėgtas, kaip ir Vietname.

Kadangi konvejerio metodas mums dar nepasiteisino, teko dirbti sunkų, alinantį darbą – vėl „sulipdyti“ genomo fragmentus. Kad aptiktų atitikmenis nesiblaškydamas nuo pasikartojimų, Gene'as Myersas pasiūlė algoritmą, pagrįstą pagrindiniu mano šautuvo metodo versijos principu: suskirstyti abiejų gautų klonų galus. Kadangi Hamas gaudavo trijų tiksliai žinomų dydžių klonus, žinojome, kad dvi galinės sekos buvo griežtai apibrėžtu atstumu viena nuo kitos. Kaip ir anksčiau, šis „suderinimo“ metodas suteiks mums puikią galimybę iš naujo surinkti genomą.

Bet kadangi kiekvienas sekos galas buvo suskirstytas atskirai, kad šis surinkimo būdas veiktų tiksliai, reikėjo atidžiai vesti įrašus – kad būtume visiškai tikri, kad visas galinių eilučių poras galime sujungti teisingai: juk jei bent vienas iš šimto bandymų sukelia klaidą ir nerandama nė vieno, kuris atitiktų nuoseklumą, viskas nukris ir metodas neveiks. Vienas iš būdų to išvengti – naudoti brūkšninius kodus ir jutiklius kiekvienam proceso etapui sekti. Bet darbo pradžioje laborantai neturėjo reikiamos programinės įrangos ir įrangos sekos nustatymui, todėl viską teko daryti rankiniu būdu. „Celera“ nedidelė, mažiau nei dvidešimties žmonių komanda kasdien apdorodavo rekordinius 200 000 klonų. Galėtume numatyti kai kurias klaidas, pvz., klaidingai nuskaitytus duomenis iš 384 šulinių, ir tada naudoti kompiuterį, kad surastume aiškiai klaidingą veiksmą ir ištaisytume situaciją. Žinoma, dar buvo ir trūkumų, bet tai tik patvirtino komandos meistriškumą ir pasitikėjimą, kad galime pašalinti klaidas.

Nepaisant visų sunkumų, per keturis mėnesius sugebėjome perskaityti 3156 milijonus sekų, iš viso apie 1,76 milijardo nukleotidų porų, esančių tarp 1,51 milijono DNR klonų galų. Dabar atėjo eilė Gene'ui Myersui, jo komandai ir mūsų kompiuteriui – reikėjo visus skyrius sujungti į Drosophila chromosomas. Kuo ilgesni skyriai, tuo tikslesnė seka tapo. Drosophila atveju sekos vidutiniškai siekė 551 bazių porą, o vidutinis tikslumas buvo 99,5%. Atsižvelgiant į 500 raidžių sekas, beveik kiekvienas gali rasti atitikmenis judindamas vieną seką išilgai kitos, kol randama atitiktis.

Norėdami sekti Haemophilus influenzae, turėjome 26 tūkstančius sekų. Norint palyginti kiekvieną iš jų su visais kitais, reikėtų 26 tūkst. palyginimų kvadratu, arba 676 mln. Drosophila genomui, turinčiam 3,156 mln. skaitymų, reikėtų maždaug 9,9 trilijonų palyginimų. Žmogaus ir pelių atveju, kai atlikome 26 milijonus sekų skaitymų, reikėjo atlikti apie 680 trilijonų palyginimų. Todėl nenuostabu, kad dauguma mokslininkų labai skeptiškai vertino galimą šio metodo sėkmę.

Nors Myersas žadėjo viską sutvarkyti, jam nuolat kilo abejonių. Dabar jis dirbo dienomis ir naktimis, atrodė išsekęs ir kažkaip pilkas. Be to, jis turėjo problemų šeimoje, o didžiąją laisvo laiko dalį pradėjo leisti su žurnalistu Jamesu Shreve'u, kuris rašė apie mūsų projektą ir kaip šešėlis sekė tyrimo eigą. Bandydamas kažkaip atitraukti Geną, pasiėmiau jį su savimi į Karibų jūrą atsipalaiduoti ir plaukioti savo jachta. Tačiau net ir ten jis sėdėjo valandų valandas, susikūpręs prie nešiojamojo kompiuterio, suraukęs juodus antakius ir merkdamas juodas akis nuo ryškios saulės. Ir, nepaisant neįtikėtinų sunkumų, Gene ir jo komanda per šešis mėnesius sugebėjo sukurti daugiau nei pusę milijono kompiuterinio kodo eilučių naujajam surinkėjui.

Jei sekos nustatymo rezultatai būtų 100% tikslūs, be pasikartojančios DNR, genomo surinkimas būtų gana paprasta užduotis. Tačiau iš tikrųjų genomuose yra daug pasikartojančių skirtingų tipų, ilgių ir dažnių DNR. Su trumpais, mažesniais nei penkių šimtų bazinių porų pakartojimais susidoroti yra gana lengva. Norėdami išspręsti šią problemą, naudojome „poros paieškos“ metodą, tai yra, sekvenavome abu kiekvieno klono galus ir gavome skirtingo ilgio klonus, kad užtikrintume maksimalų atitikmenų skaičių.

Algoritmai, užkoduoti Jin komandos pusėje milijono kompiuterinio kodo eilučių, pasiūlė nuoseklų scenarijų – nuo ​​pačių „nekenksmingiausių“ veiksmų, tokių kaip tiesiog dviejų sekų sutapimas, iki sudėtingesnių, tokių kaip aptiktų porų naudojimas. sujungti persidengiančių sekų salas. Tai buvo tarsi dėlionės dėliojimas, kai iš surinktų sekcijų mažos salelės sujungiamos į didesnes salas, o tada visas procesas kartojamas dar kartą. Tik mūsų dėlionėje buvo 27 milijonai dalių. Ir buvo labai svarbu, kad sekcijos būtų paimtos iš aukštos kokybės surinkimo sekos: įsivaizduokite, kas nutiktų, jei surinktumėte dėlionę, o jos elementų spalvos ar vaizdai būtų neryškūs ir neryškūs. Didelė dalis nuskaitymų turi būti suderintų porų pavidalu, kai genomo sekos tvarka yra didelė. Atsižvelgdami į tai, kad rezultatai vis dar buvo stebimi rankiniu būdu, mums palengvėjo, kad 70 % mūsų turimų sekų buvo būtent tokios. Kompiuteriniai modeliuotojai paaiškino, kad naudojant mažesnį procentą būtų buvę neįmanoma surinkti mūsų „Humpty Dumpty“.

Ir dabar mes galėjome naudoti „Celera“ surinkėją, kad galėtume sekti seką: pirmajame etape rezultatai buvo pakoreguoti, kad būtų pasiektas didžiausias tikslumas; antrajame žingsnyje Screener programa pašalino užkrečiančias sekas iš plazmidės arba E. coli DNR. Surinkimo procesą gali sutrikdyti vos 10 „svetimos“ sekos bazinių porų. Trečiajame etape programa „Screener“ patikrino, ar kiekvienas fragmentas atitinka žinomas pasikartojančias vaisinės muselės genomo sekas – duomenis iš Jerry Rubino, kuris „maloniai“ mums jas pateikė. Buvo užfiksuotos pakartojimų su iš dalies persidengiančiais regionais vietos. Ketvirtajame žingsnyje kita programa (Overlapper) atrado persidengiančias sritis, lygindama kiekvieną fragmentą su visais kitais – tai buvo milžiniškas eksperimentas apdorojant didžiulį skaičių skaitinių duomenų. Kiekvieną sekundę palyginome 32 milijonus fragmentų, siekdami rasti bent 40 persidengiančių bazinių porų, kurių skirtumai yra mažesni nei 6%. Kai atradome du persidengiančius regionus, sujungėme juos į didesnį fragmentą, vadinamąjį „contig“ – persidengiančių fragmentų rinkinį.

Idealiu atveju to pakaktų genomui surinkti. Tačiau turėjome kovoti su DNR kodo mikčiojimu ir pasikartojimais, o tai reiškė, kad viena DNR dalis gali sutapti su keliais skirtingais regionais, sukurdama netikrus ryšius. Norėdami supaprastinti užduotį, palikome tik unikaliai sujungtus fragmentus, vadinamuosius „vienetus“. Programa, kurią naudojome šiai operacijai atlikti (Unitigger), iš esmės pašalino visą DNR seką, kurios negalėjome tiksliai identifikuoti, palikdama tik šiuos vienetus. Šis žingsnis ne tik suteikė galimybę apsvarstyti kitas fragmentų surinkimo galimybes, bet ir gerokai supaprastino užduotį. Po sumažinimo persidengiančių fragmentų skaičius sumažėjo nuo 212 mln. iki 3,1 mln., o problema supaprastinta 68 kartus. Dėlionės dalys pamažu, bet stabiliai stojo į savo vietas.

Ir tada galėtume panaudoti informaciją apie tai, kaip to paties klono sekos buvo suporuotos naudojant „skeleto“ algoritmą. Visi įmanomi vienetai su tarpusavyje persidengiančiomis bazių poromis buvo sujungti į specialias struktūras. Šiam etapui apibūdinti savo paskaitose remiu analogiją su vaikiškų žaislų konstravimo rinkiniu Tinkertoys. Jį sudaro skirtingo ilgio pagaliukai, kuriuos galima įsmeigti į skylutes, esančias ant medinių raktų dalių (rutulių ir diskų), ir taip sukurti trimatę struktūrą. Mūsų atveju pagrindinės dalys yra vienetai. Žinant, kad suporuotos sekos yra 2 tūkstančių, 10 tūkstančių ar 50 tūkstančių bazinių porų ilgio klonų galuose – tai yra, atrodo, kad jos viena nuo kitos yra tam tikro skylių skaičiaus atstumu – jas galima išrikiuoti.

Išbandžius šią techniką su Jerry Rubino seka, kuri sudarė maždaug penktadalį vaisinės muselės genomo, atsirado tik 500 spragų. Bandydami pagal savo duomenis rugpjūčio mėn., gavome daugiau nei 800 000 mažų fragmentų. Žymiai didesnis duomenų kiekis apdorojimui parodė, kad technika veikė prastai – rezultatas buvo priešingas nei tikėtasi. Per kelias ateinančias dienas panika augo, o galimų klaidų sąrašas ilgėjo. Iš viršutinio pastato Nr. 2 aukšto adrenalino antplūdis prasiskverbė į patalpą, juokais vadinamą „ramiomis kameromis“. Tačiau ten nebuvo nei ramybės, nei ramybės jausmo, ypač bent porą savaičių, kai darbuotojai tiesiogine prasme blaškėsi ratais, ieškodami išeities iš susidariusios situacijos.

Problemą galiausiai išsprendė Arthuras Delcheris, dirbęs su „Overlapper“ programa. Jis pastebėjo kažką keisto 678 eilutėje iš 150 000 kodo eilučių, kur nedidelis neatitikimas reiškė, kad nebuvo įrašyta svarbi rungtynių dalis. Klaida buvo ištaisyta ir rugsėjo 7 d. turėjome 134 ląstelių karkasus, dengiančius tikrąjį (euchromatinį) vaisinės muselės genomą. Mes apsidžiaugėme ir lengviau atsikvėpėme. Atėjo laikas pranešti apie mūsų sėkmę visam pasauliui.

Genomo sekos nustatymo konferencija, kurią pradėjau rengti prieš keletą metų, suteikė tam puikią galimybę. Buvau tikras, kad bus daug žmonių, norinčių įsitikinti, ar ištesėjome pažadą. Nusprendžiau, kad Markas Adamsas, Gene'as Myersas ir Jerry'is Rubinas turėtų pakalbėti apie mūsų pasiekimus ir, svarbiausia, apie sekos nustatymo procesą, genomo surinkimą ir to reikšmę mokslui. Dėl žmonių, norinčių atvykti į konferenciją, antplūdžio, turėjau perkelti ją iš „Hilton Head“ į didesnį „Fontainebleau“ viešbutį Majamyje. Konferencijoje dalyvavo stambių farmacijos ir biotechnologijų įmonių atstovai, genominių tyrimų specialistai iš viso pasaulio, nemažai apžvalgininkų, reporterių ir investicinių bendrovių atstovų – buvo visi. Mūsų konkurentai iš Incytės išleido nemažus pinigus rengdami priėmimą po konferencijos, korporacinių vaizdo filmavimų ir pan. – padarė viską, kad įtikintų visuomenę, jog jie siūlo „išsamiausią informaciją apie žmogaus genomą“.

Susirinkome didelėje konferencijų salėje. Dekoruotas neutraliomis spalvomis, dekoruotas sieniniais šviestuvais, buvo skirtas dviems tūkstančiams žmonių, bet žmonių vis užeidavo, netrukus salė prisipildė. Konferencija atidaryta 1999 m. rugsėjo 17 d., pirmoje sesijoje skaitė Jerry, Mark ir Gene pranešimus. Po trumpos įžangos Jerry Rubinas paskelbė, kad publika netrukus išgirs apie geriausią bendrą garsių kompanijų projektą, kuriame jis kada nors dalyvavo. Atmosfera kaitino. Publika suprato, kad jis nebūtų taip pompastiškai kalbėjęs, jei nebūtume paruošę kažko tikrai sensacingo.

Paskendusioje tyloje Markas Adamsas pradėjo išsamiai apibūdinti mūsų „pagamintos parduotuvės“ Celeroje darbą ir naujus genomo sekos nustatymo metodus. Tačiau apie surinktą genomą jis nepratarė nė žodžio, tarsi erzindamas publiką. Tada Gene išėjo ir papasakojo apie šautuvo metodo principus, apie Haemophilus sekos nustatymą ir apie pagrindinius surinkėjo etapus. Naudodamas kompiuterinę animaciją, jis pademonstravo visą atvirkštinio genomo surinkimo procesą. Pristatymams skirtas laikas baigėsi, ir daugelis jau buvo nusprendę, kad viskas apsiribos elementariu pristatymu naudojant PowerPoint, nepateikiant konkrečių rezultatų. Tačiau tada Gene piktybiškai šypsodamasis pažymėjo, kad publika tikriausiai vis tiek norėtų pamatyti realius rezultatus ir nebūtų patenkinta imitacija.

Neįmanoma pateikti mūsų rezultatų aiškiau ir išraiškingiau nei Gene Myers. Jis suprato, kad vien sekos nustatymo rezultatai nepadarys tinkamo įspūdžio, todėl, kad būtų įtikinamesni, palygino juos su Jerry kruopštaus tyrimo tradiciniu metodu rezultatais. Jie pasirodė identiški! Taigi, Jin palygino mūsų genomo surinkimo rezultatus su visais žinomais žymenimis, susietais su vaisinės musės genomu prieš dešimtmečius. Iš tūkstančių žymeklių tik šeši neatitiko mūsų surinkimo rezultatų. Atidžiai ištyrę visas šešias, įsitikinome, kad „Celera“ seka buvo teisinga ir kad kitose laboratorijose senais metodais atliktame darbe yra klaidų. Galiausiai Gene pasakė, kad mes ką tik pradėjome nustatyti žmogaus DNR seką, o pasikartojimai tikriausiai bus mažesnė problema nei su Drosophila.

Po to sekė garsūs ir ilgai trunkantys plojimai. Per pertrauką nesiliaujantis riaumojimas reiškė, kad tikslą pasiekėme. Vienas iš žurnalistų pastebėjo, kaip liūdnai kraipo galvą vyriausybės genomo projekto dalyvis: „Atrodo, šie niekšai tikrai padarys viską Iš konferencijos išėjome su nauju energijos užtaisu.

Liko išspręsti dvi svarbias problemas, kurios abi buvo mums žinomos. Pirma, kaip paskelbti rezultatus. Nepaisant supratimo memorandumo, kurį pasirašėme su Jerry Rubinu, mūsų verslo komanda nebuvo patenkinta idėja perduoti vertingus Drosophila sekos rezultatus į GenBank. Jie pasiūlė vaisinių muselių sekos rezultatus patalpinti į atskirą Nacionalinio biotechnologijų informacijos centro duomenų bazę, kur kiekvienas galėtų juos naudoti su viena sąlyga – ne komerciniais tikslais. Karštaus būdo, grandininis rūkantis Michaelas Ashburneris iš Europos bioinformatikos instituto dėl to buvo itin nepatenkintas. Jis tikėjo, kad Celera „apgavo visus“ 2. (Jis rašė Rubinui: „Kas, po velnių, vyksta Celeroje?“ 3) Collinsas taip pat buvo nepatenkintas, bet dar svarbiau – Džeris Rubinas. Galų gale aš išsiunčiau mūsų rezultatus į GenBank.

Antroji problema buvo susijusi su Drosophila – turėjome jos genomo sekos nustatymo rezultatus, bet visiškai nesupratome, ką jie reiškia. Reikėjo juos analizuoti, jei norėjome rašyti referatą, kaip ir prieš ketverius metus Haemophilus atveju. Musės genomo analizė ir charakterizavimas gali užtrukti ne vienerius metus – o aš tiek laiko neturėjau, nes dabar turėjau susitelkti ties žmogaus genomu. Aptarę tai su Jerry ir Marku, nusprendėme įtraukti mokslo bendruomenę į darbą su Drosophila, paversdami jį įdomia moksline problema ir taip greitai pajudėdami šį klausimą į priekį, paversdami linksmas atostogas iš nuobodaus genomo aprašymo proceso. kaip tarptautinis skautų jamboree. Pavadinome jį Genominiu Jamboree ir pakvietėme žymiausius mokslininkus iš viso pasaulio atvykti į Rokvilį maždaug savaitei ar dešimčiai dienų, kad ištirtų musės genomą. Remdamiesi gautais rezultatais, planavome parašyti straipsnių ciklą.

Idėja visiems patiko. Džeris pradėjo siųsti kvietimus į mūsų renginį pirmaujančių mokslininkų grupėms, o „Celera“ bioinformatikos specialistai nusprendė, kokių kompiuterių ir programų reikės, kad mokslininkų darbas būtų kuo efektyvesnis. Sutarėme, kad Celera apmokės jų kelionės ir apgyvendinimo išlaidas. Tarp pakviestųjų buvo mano aršiausi kritikai, tačiau tikėjomės, kad jų politinės ambicijos nepaveiks mūsų įmonės sėkmės.

Lapkričio mėnesį pas mus atvyko apie 40 Drosophila specialistų ir net mūsų priešams pasiūlymas buvo per daug patrauklus, kad būtų galima atsisakyti. Iš pradžių, kai dalyviai suprato, kad per kelias dienas turi išanalizuoti daugiau nei šimtą milijonų bazinių porų genetinio kodo, situacija buvo gana įtempta. Kol naujai atvykę mokslininkai miegojo, mano darbuotojai dirbo visą parą, kūrė programas nenumatytoms problemoms spręsti. Trečios dienos pabaigoje, kai paaiškėjo, kad nauji programinės įrangos įrankiai leidžia mokslininkams, kaip sakė vienas iš mūsų svečių, „per kelias valandas padaryti nuostabių atradimų, kurie anksčiau užtrukdavo beveik visą gyvenimą“, situacija nurimo. Kiekvieną dieną vidury dienos, Kinijos gongo signalui, visi susirinkdavo kartu aptarti naujausių rezultatų, spręsti esamas problemas ir sudaryti darbo planą kitam etapui.

Kiekvieną dieną diskusijos darėsi vis įdomesnės. Celeros dėka mūsų svečiai turėjo galimybę pirmieji pažvelgti į naują pasaulį, o tai, kas buvo atskleista, pranoko lūkesčius. Netrukus paaiškėjo, kad neturėjome pakankamai laiko aptarti visko, ko norėjome, ir suprasti, ką visa tai reiškia. Markas surengė šventinę vakarienę, kuri truko neilgai, nes visi greitai nuskubėjo atgal į laboratorijas. Netrukus pietūs ir vakarienės buvo vartojami tiesiai prieš kompiuterių ekranus, kuriuose buvo rodomi duomenys apie Drosophila genomą. Pirmą kartą buvo atrastos ilgai lauktos receptorių genų šeimos ir stebėtinai daug vaisinių muselių genų, panašių į žmogaus ligų genus. Kiekvieną atradimą lydėjo džiaugsmingi riksmai, švilpimai ir draugiški pečių paglostymai. Keista, bet mūsų mokslo šventėje viena pora rado laiko susižadėti.

Vis dėlto nerimo būta: darbo metu mokslininkai aptiko tik apie 13 tūkstančių genų vietoj lauktų 20 tūkstančių. Kadangi „žemas“ kirminas C. elegans turi apie 20 tūkstančių genų, daugelis manė, kad vaisinėje muselėje jų turi būti daugiau, nes ji turi 10 kartų daugiau ląstelių ir netgi turi nervų sistemą. Buvo vienas paprastas būdas įsitikinti, kad skaičiavimuose nėra klaidų: paimkite 2500 žinomų musės genų ir pažiūrėkite, kiek jų galime rasti savo sekoje. Po kruopščios analizės Michaelas Cherry iš Stanfordo universiteto pranešė, kad rado visus genus, išskyrus šešis. Po diskusijos šie šeši genai buvo klasifikuojami kaip artefaktai. Tai, kad genai buvo nustatyti be klaidų, mus įkvėpė ir suteikė pasitikėjimo. Tūkstančiai mokslininkų, atsidavusių Drosophila tyrimams, bendruomenė praleido dešimtmečius stebėdama tuos 2500 genų, o dabar net 13 600 jų buvo priešais juos kompiuterio ekrane.

Per neišvengiamą fotosesiją darbo pabaigoje atėjo nepamirštama akimirka: po tradicinio peties paglostymo ir draugiškų rankų paspaudimų Mike'as Ashburneris atsisėdo keturiomis, kad galėčiau įsiamžinti nuotraukoje pasidėjęs koja ant nugaros. . Taigi, nepaisant visų savo abejonių ir skepticizmo, jis norėjo pripažinti mūsų pasiekimus. Garsus genetikas ir Drosophila tyrinėtojas netgi sugalvojo tinkamą nuotraukos antraštę: „Stovinti ant milžino pečių“. (Jis buvo gana silpnos figūros.) „Pagerbkime tuos, kurie to nusipelnė“, – vėliau rašė jis 4 . Mūsų oponentai bandė pateikti vėlavimą perkelti sekų nustatymo rezultatus į viešą duomenų bazę kaip nukrypimą nuo mūsų pažadų, tačiau jie taip pat buvo priversti pripažinti, kad susitikimas padarė „labai vertingą indėlį į pasaulinius vaisinių muselių tyrimus“ 5 . Patyrę, kas yra tikroji „mokslinė nirvana“, visi išsiskyrė kaip draugai.

Nusprendėme paskelbti tris didelius straipsnius: vieną apie viso genomo sekos nustatymą, kai pirmasis autorius yra Mike'as, kitą apie genomo surinkimą, kai pirmasis autorius yra Gene, ir trečią apie lyginamąją kirminų, mielių ir žmogaus genomo genomiką, o pirmasis autorius yra Džeris. autorius. Straipsniai buvo pateikti „Science“ 2000 m. vasario mėn. ir paskelbti specialiame numeryje 2000 m. kovo 24 d., praėjus mažiau nei metams po mano pokalbio su Jerry Rubinu Cold Spring Harbore. 6 Prieš paskelbdamas, Džeris pasirūpino, kad kalbėčiau kasmetinėje Drosophila tyrimų konferencijoje Pitsburge, kurioje dalyvavo šimtai žymiausių šios srities žmonių. Ant kiekvienos kėdės kambaryje mano darbuotojai padėjo kompaktinį diską, kuriame buvo visas Drosophila genomas, taip pat mūsų žurnale Science paskelbtų straipsnių perspausdinimai. Džeris mane labai šiltai pristatė, patikindamas minią, kad įvykdžiau visus savo įsipareigojimus ir puikiai dirbome kartu. Mano pokalbis baigėsi kai kurių susitikimo metu atliktų tyrimų ataskaita ir trumpu kompaktiniame diske esančių duomenų komentaru. Plojimai po mano kalbos buvo tokie pat nuostabūs ir malonūs, kaip ir prieš penkerius metus, kai mes su Hamu pirmą kartą pristatėme Haemophilus genomą mikrobiologijos suvažiavime. Vėliau straipsniai apie Drosophila genomą tapo dažniausiai cituojamais straipsniais mokslo istorijoje.

Nors tūkstančiai vaisinių muselių tyrinėtojų visame pasaulyje džiaugėsi rezultatais, mano kritikai greitai ėmėsi įpuolimo. Johnas Sulstonas bandymą nustatyti musės genomo seką pavadino nesėkme, nors mūsų gauta seka buvo išsamesnė ir tikslesnė nei jo kruopštaus dešimties metų pastangų sekti kirmino genomą, kuriai užbaigti prireikė dar ketverių metų, rezultatas. paskelbus juodraštį Moksle. Sulstono kolega Maynardas Olsonas pavadino Drosophila genomo seką „gėda“, kurią vyriausybės Žmogaus genomo projektas turės išspręsti Celeros „malonės dėka“. Tiesą sakant, Jerry Rubino komanda sugebėjo greitai užpildyti likusias sekos spragas, paskelbdama ir palyginus išanalizavusi jau sekvenuotą genomą per mažiau nei dvejus metus. Šie duomenys patvirtino, kad visame genome turėjome 1–2 klaidas 10 kb, o darbiniame (euchromatiniame) genome - mažiau nei 1 paklaidą 50 kb.

Tačiau nepaisant visuotinio Drosophila projekto pripažinimo, įtampa mano santykiuose su Tony White'u 1999 m. vasarą pasiekė karštligę. White'as negalėjo susitaikyti su dėmesiu, kurį spauda skyrė mano asmeniui. Kiekvieną kartą atvykęs į Celerą jis praeidavo pro straipsnių kopijas apie mūsų pasiekimus, kabėjusias ant sienų koridoriuje šalia mano biuro. Ir štai vieną jų padidinome – sekmadienio laikraščio „USA Today“ priedo viršelį. Ant jos antraštės „Ar šis ADVENTURIKAS padarys didžiausią mūsų laikų mokslinį atradimą? 7 parodė mane, mėlynais languotais marškiniais, sukryžiavusį kojas, o aplink mane ore sklandė Kopernikas, Galilėjus, Niutonas ir Einšteinas – ir nė ženklo Baltojo.

Kiekvieną dieną jo spaudos sekretorius skambindavo pasiteirauti, ar Tony galėtų dalyvauti iš pažiūros nesibaigiančioje Celeroje vykstančioje interviu sraute. Jis šiek tiek nurimo – ir net tada tik trumpam, kai kitais metais jai pavyko padaryti jo nuotrauką ant žurnalo „Forbes“ viršelio, kaip žmogaus, sugebėjusio padidinti PerkinElmer kapitalizaciją nuo 1,5 mlrd. USD iki 24 mlrd. USD 8 . („Tony White‘as vargšą PerkinElmerį pavertė aukštųjų technologijų genų gaudykle.“) Tonį taip pat persekiojo mano socialinė veikla.

Kartą per savaitę kalbėjau, priimdama nedidelę dalį daugybės kvietimų, kuriuos nuolat gaunu, nes pasaulis norėjo sužinoti apie mūsų darbą. Tonis netgi skundėsi PerkinElmer, tuo metu pervadintos į PE Corporation, direktorių valdybai, kad mano kelionės ir pasirodymai pažeidė įmonės taisykles. Per dvi savaites trukusias atostogas (savo lėšomis) mano namuose Cape Cod Tony kartu su finansų direktoriumi Dennisu Wingeriu ir Applera generaliniu advokatu Williamu Sauchu nuskrido į Celerą, kad apklaustų mano geriausius darbuotojus apie „Venter“ valdymo efektyvumą. Jie tikėjosi surinkti pakankamai purvo, kad pateisintų mano atleidimą. White'as buvo šokiruotas, kai visi sakė, kad jei aš išstosiu, jie taip pat pasitrauks. Tai sukėlė daug įtampos mūsų komandoje, bet taip pat suartino mus kaip niekad. Buvome pasirengę švęsti kiekvieną pergalę taip, lyg ji būtų paskutinė.

Po to, kai buvo paskelbta musės genomo seka – tuo metu didžiausia seka istorijoje – Gene, Ham, Mark ir aš pasidžiaugėme, kad Tony White'as stovėjo pakankamai ilgai, kad būtų pripažinta mūsų sėkmė. Įrodėme, kad mūsų metodas taip pat veiks nustatant žmogaus genomo seką. Net jei Tony White'as kitą dieną nustotų finansuoti, žinojome, kad pagrindinis mūsų pasiekimas liks mums. Labiau už viską norėjau palikti Celerą ir neturėti reikalų su Tony White'u, bet kadangi norėjau dar labiau sekti Homo sapiens genomą, turėjau padaryti kompromisą. Stengiausi kiek galėdamas įtikti White'ui, kad tik tęsčiau darbą ir užbaigčiau savo planą.

Pastabos

1. Shreeve J. Genomo karas: kaip Craigas Venteris bandė užfiksuoti gyvybės kodą ir išgelbėti pasaulį (New York: Ballantine, 2005), p. 285.

2. Ashburner M. Won for All: How the Drosophila Genome Was Sequenced (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2006), p. 45.

3. Shreeve J. Genomo karas, p. 300.

4. Ashburner M. Won for All, p. 55.

5. Sulston J., Ferry G. The Common Thread (Londonas: Corgi, 2003), p. 232.

6. Adams M. D., Celniker S. E. ir kt. „Drosophila Melanogaster genomo seka“, Mokslas, Nr. 287, 2185–95, 2000 m. kovo 24 d.

7. Gillis J. „Ar šis MAVERICK atrakins didžiausią savo amžiaus mokslinį atradimą? Kopernikas, Niutonas, Einšteinas ir VENTERIS?“, JAV savaitgalis, 1999 m. sausio 29–31 d.

8. Ross P. E. „Genų mašina“, „Forbes“, 2000 m. vasario 21 d.

Craigas Venteris